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流式细胞术在耳鼻喉科疾病研究中的应用

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【BD 生命科学 - Pharmingen简介】

★Pharmingen公司成立于1987年，位于美国圣地亚哥。★产品涉及细胞生物学、免疫学等诸多领域

★公司开发的单克隆、多克隆系列抗体、重组蛋白、流式液相多重蛋白定量技术、流式检测蛋白磷酸化技术在科研以及临床研究中享有极高的声誉。

★1997年与BD合并，借助BD在流式检测领域的优势，成为流式抗体最主要的供应商，也随之开发了许多基于流式检测的新产品。

【主要内容】

★学科免疫学研究进展 ★CBA（流式液相蛋白定量技术）：①技术原理及优势 ②应用 ★Phosflow：①技术原理及优势 ②检测方法

实例：流式在鼻窦炎研究中的应用

实例：过敏性鼻炎T细胞趋化因子受体表达

研究背景

趋化因子受体在花粉过敏性鼻炎患者T细胞的表达和功能

实验方法

★样本
外周血
●花粉过敏性鼻炎9例
●接受免疫治疗患者9例
●正常对照9例

★鼻腔活体组织
●花粉过敏性鼻炎7例
●正常对照7例

★流式细胞表面/胞内表型分析
CD4+/CD8+ T细胞
CCR1-7、CXCR1-4
IL-4、IFN-γ

实例1：过敏性鼻炎T细胞趋化因子受体表达	实例：过敏性鼻炎T细胞趋化因子受体表达

CCR3在花粉过敏性鼻炎患者CD4+T细胞高表达	CCR3+CD4+细胞诱导Th2类免疫反应

实例：流式在鼻窦炎研究中的应用

小结:CCR3+ CD4+ T细胞在过敏性鼻炎患者样本中表达上调，并且诱导Th2 类免疫反应

【T细胞免疫】

★T细胞在多种病原体的适应性免疫反应中发挥着重要的作用；

★BD生物科学为研究Th1/Th2/Th9/Th17/Tfh/NKT/Treg提供了多种产品，包括荧光结合抗体和检测试剂盒。

【人免疫细胞表型8色鉴定方案- by Human Immunophenotyping Consortium 】

Nat Rev Immunol, 2012

【T细胞分型和概况】

辅助性T细胞	调节性T细胞

Th1/Th2/Th9/Th17/Tfh 表面/胞内染色 CBA/ELISA/ELISOPT 重组蛋白

实例2：过敏性鼻炎患者DC细胞IgE受体表达&免疫调控

研究背景	★IgE ●介导过敏反应 ●过敏性疾病，如哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹等表达升高 ★IgE受体 ●抗原提呈细胞FcɛRI表达和功能
实验方法	★样本 ●11例过敏性鼻炎，12例非过敏性慢性鼻炎患者 ●手术切除的鼻甲组织 ●DC	★流式细胞术 ●抗原表型分析 ●流式细胞术微球阵列法(CBA)检测细胞因子浓度 CBA Human Inflammatory Cytokine Kit (IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF)
结论	慢性鼻炎患者FcɛRI表达受到细胞因子的调节

实例2：过敏性鼻炎患者DC细胞IgE受体表达&免疫调控

小结：过敏性鼻炎患者DC细胞FcɛRI表达上调，受到IL-10的抑制性调控

实例：CRSwNP患者IL-6信号通路受到抑制

实例：CRSwNP患者IL-6信号通路受到抑制

研究背景	IL-6、IL-6R、膜蛋白gp130共同激活STAT3磷酸化，诱导炎症反应，调节机体免疫应答
实验方法	CRSsNP & CRSwNP疾病模型内镜鼻窦手术患者sinus tissue extracts和鼻腔灌洗液流式细胞术微球阵列法(CBA)检测细胞因子浓度 IL-6、可溶性IL-6R、可溶性gp130 Western Blot检测p-STAT3
实验结果	IL-6、sIL-6R、sgp130表达水平在CRSwNP患者中明显高于CRSsNP和正常对照组 p-STAT3在CRSwNP患者中表达水平下调
结论	IL-6信号通路在CRSwNP疾病中被抑制
临床意义	IL-6信用通路受到抑制可能是导致CRSwNP疾病的诱导因素

细胞因子的免疫学检测方法	BD CBATM (Cytometric Bead Array)
ELISA 方法 ELISpot方法胞内染色流式检测方法（ICFC）流式液相多重蛋白定量技术（CBA）利用不同的微球，同时分析样本中多种可溶性蛋白的流式检测方法	疾病诊断免疫调节： ①细胞因子②粘附分子③趋化因子药物/物理治疗效果评价

Why CBA?	CBA – ELISA终结者
人外周血30种蛋白因子检测	人外周血30种蛋白因子检测同时检测单个样本的多个指标

【CBA原理】

一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物

【BD CBATM (Cytometric Bead Array)】

BD CBA是一种利用不同的微球，同时分析微量、液相样本中多种可溶性成分的流式检测方法。即通过一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。

【CBA Flex Set的分析软件 -- FCAP Array Software v3.0】

【CBA和ELISA比较】

BD CBA	ELISA
样本用量少，多指标检测操作方便，节省时间同一样本同时检测，误差小，精密度高无酶-底物背景干扰	样本用量大，单指标检测操作费时费力系统操作误差大酶-底物背景干扰低表达样本检测-ELISA检测数值明显高于CBA(假阳性结果)

【BD CBA实验流程】

【CBA/CBA Flex Set应用范围】

★检测对象

血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上清、细胞裂解物等

★应用领域

血清、血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的浓度检测肿瘤研究及肿瘤疾病的辅助诊断、疗效和预后监测

干细胞研究和干细胞治疗监测免疫学研究和免疫疾病的辅助诊断和监控

感染疾病的研究及辅助诊断和疗效评价免疫细胞功能性研究

免疫疾病的监控药效评价，药物研发、疫苗研究

细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析

★BD CBA Kits 为保证常规方案结果的一致性做好了预配置。

★BD CBA Flex Sets提供了开放的、可配置的检测方法，使得研究人员可以建立自己的多元检测

【现有CBA Kit产品】

★Human Th1/Th2 Cytokine Kit--包含因子：IL-2, IL-4, IL-5 (或IL-6), IL-10, TNF, IFN-γ

★Human Th1/Th2/Th17 Kit--包含因子：IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A

★Human Anaphylatoxin Kit--包含因子：C4a, C3a, C5a

★Human Inflammation Kit--包含因子：IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70

★Human Chemokine Kit--包含因子：IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10

★对应有小鼠的产品

【现有CBA Flex Set产品】

【磷酸化的传统检测方法-Western Blot】

利用收集的整体细胞群

裂解细胞释放信号蛋白

凝胶电泳分离蛋白

转蛋白或印迹到膜上

加待检蛋白的抗体

通过比色或其他方法评价

耗时：1-1.5天

【BD Phosflow】

★Phosflow是基于流式的一种创新技术,轻松实现单细胞水平分析多种蛋白的活化状态.

★Phosflow除了能看到整体表达外，更重要的是对单个细胞的胞内信号转导事件进行详尽的研究

【胞内磷酸化的流式细胞技术(Phosflow)原理】

【BD Phosflow 优势-精准】

【BD Phosflow 优势-多参数分析】

BD Phosflow Staining in PBMC Stimulated with TLR Ligand

【Phosflow和WB比较】

BD Phosflow	Western Blot
单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准	群体分析，得到多个细胞的平均值
多参数，同时分析多种胞内磷酸化标记分子和细胞表面标记分子，更全面	单参数，一次只能得到单独的数据
所需样本量少，即可用全血也可用分离的细胞或细胞系	所需样本量大，只能用分离的细胞或细胞系，不可用全血
省时，1.5 小时左右	费时，1-1.5天
高通量	低通量