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蛋白翻译后修饰(PTM)检测利器-Cytoskeleton Signal Seeker 产品线
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蛋白翻译后修饰（PTM），包括乙酰化、磷酸化、苏木化、泛素化等修饰。PTM很好地解释了蛋白质组的复杂性。对于任何给定的蛋白质，多种PTM通过改变蛋白质的结构和功能来促进细胞的快速变化。PTM在信号转导，蛋白质稳定性和转换，蛋白间识别和相互作用以及空间定位方面发挥关键作用。
对于高丰度修饰蛋白的检测，可使用常规蛋白质组学的方法，将蛋白直接进行MS分析。但是，对于低丰度和内源性蛋白，则要经过蛋白富集过程。目前，常用的检测低丰度和内源性PTM的方法是通过IP富集修饰蛋白，然后通过WB或质谱进行PTM的分析。
步骤如下图所示：
.png) 先使用lysis buffer制备细胞裂解液，加入特异性的PTM抗体和珠子与修饰蛋白结合以免疫沉淀蛋白，使用wash buffer冲洗掉未结合蛋白，再使用elution buffer分离PTM修饰蛋白。之后做WB或质谱分析。Cytoskeleton提供实验过程的全套试剂。以上实验中，IP是核心步骤，IP可富集目标蛋白上的特定PTM或低丰度的PTM。在检测过程当中，有一个潜在的问题，即IP抗体可能会从珠子上洗涤下来，从而存在于样本中。做WB分析时，会显示20KDa-50KDa的条带，对感兴趣蛋白（POI）的检测造成干扰。
针对以上存在的干扰问题，Cytoskeleton提供优化的亲和珠子Signal-seeker affinity beads，由抗体与珠子偶联组成，结合更牢固，保证抗体不会被洗脱下来，不会对POI的检测造成干扰。其已经通过常用试剂验证，非常有利于分离高丰度和低丰度PTM。
Cytoskeleton首次提供无抗体干扰的内源性单泛素化和聚泛素化检测产品，同时也首次提供简化的目标蛋白乙酰化检测的试剂。提供的产品包括修饰检测试剂盒、亲和珠子、溶解过滤试剂盒、抗体。
其Signal Seeker PTM检测试剂盒可用于任何细胞或组织裂解液，提供关键抑制剂，优化的缓冲系统和用于增强修饰蛋白分离的过滤器，并缩短优化时间。最重要的是，此试剂盒可捕获低丰度的，内源性的PTM；提供的抗体包括赖氨酸乙酰化、酪氨酸磷酸化、SUMO-2/3和泛素化小鼠单抗。
以Signal-Seeker ™ SUMO 2/3 试剂为例，对其抗体和亲和珠子的检测结果如下图：
图1. 说明：WB（1:500稀释）检测12F3 SUMO 2/3抗体（ASM23）。（A）重组SUMO-2 (40-0.6 ng) 和SUMO-1 (800 ng)的含量；（B）Hela细胞裂解液热激（泳道2），未处理（泳道3），SUMO 2 shRNA敲除（泳道4）。每个样本使用20μg的Hela细胞。（C）亲本Hela细胞裂解液（泳道1），SUMO-2 shRNA对照裂解液（泳道2），SUMO-1 shRNA敲除的细胞裂解液（泳道3），SUMO-2 shRNA敲除的细胞裂解液（泳道4）。箭头标出了SUMO-2/3。SUMO 2/3抗体特异性识别SUMO 2/3，不识别SUMO-1。
.png) 图2.说明：使用添加了deSUMOylase抑制剂 (NEM)的BlastR裂解缓冲液裂解未处理的、紫杉酚10nM、血清限制（0%FBS）处理的Hela细胞。每种裂解液的1mg与推荐用量的SUMO 2/3亲和珠子(ASM24-beads)或IgG对照珠子(CIG01)孵育。SDS-PAGE分离免疫沉淀的样本，然后转到PVDF膜。RhoGDI同时做WB分析。Cytoskeleton 亲和珠子富集能力强。
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