首页  > 专题中心
专题中心

手把手课程之WB优化,本期品牌:R&D Systems

 


本文首发微信公众平台:优宁维抗体专家

Western Blot 现在仍然是检测和分离蛋白最常用的一种实验方法,但是要想得到较好的结果并不容易,只有找到合适的实验条件并进行优化,才能以更少的时间得到更多的结果,达到事半功倍的效果!

下面是R&D Systems 品牌为您推荐的免疫印迹优化步骤和实验涉及参考数据:

 

一抗浓度对实验结果的影响

抗体:Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog # AF992)

样本:人HeLa细胞  Fig.1

A:5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

B:5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.2 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

 

Fig.1

 

脱脂奶粉及NaCl 浓度对实验结果的影响

抗体:Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)

蛋白分离:人 HeLa细胞 (Lane 1),MCF-7 (Lane 2)和TF-1 (Lane 3)  Fig.2

A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于2% 脱脂奶粉和0.15 M NaCl

B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉和0.15 M NaCl

C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉和0.5 M NaCl

Fig.2

 

一抗浓度、一抗溶液中脱脂奶粉含量及印迹缓冲液中NaCl 浓度对实验结果的影响

抗体:Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)

2% 脱脂奶粉溶液中一抗浓度对实验结果的影响 Fig.3:

A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.3 mg/mL,溶于2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.1 mg/mL,溶于2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

 

 Fig.3

 

5% 脱脂奶粉溶液中一抗浓度对实验结果的影响 Fig.4:

A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.3 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.1 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

 

Fig.4

印迹缓冲液中NaCl 浓度对实验结果的影响 Fig.5:

A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉,0. 5 M NaCl

Fig.5

 

印迹溶液中NaCl 浓度对实验结果的影响

抗体:Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog# AF992)

样本:人HeLa细胞 Fig.6

A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉和0.15 M NaCl

B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于5% 脱脂奶粉和0.5 M NaCl

 

Fig.6

 

我们为您推荐实验设计数据参考:

裂解缓冲液: 

蛋白定位 裂解液 推荐试剂盒
全细胞 NP-40 or RIPA 全蛋白抽提试剂盒
细胞质(可溶蛋白) Tris-HCl 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒
线粒体蛋白提取试剂盒
细胞质(细胞骨架 等不溶蛋白) Tris-Triton 蛋白分级抽提试剂盒
细胞膜 NP-40 or RIPA 膜蛋白抽提试剂盒
蛋白分级抽提试剂盒
细胞核 RIPA 核蛋白抽提试剂盒
线粒体 RIPA 线粒体蛋白抽提试剂盒
亚细胞定位蛋白抽提试剂盒


蛋白酶磷酸酶抑制剂:

抑制剂 蛋白酶或磷酸酶
PMSF 丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶
Leupeptin 亮肽素 抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶,如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B
Aprotinin 抑肽酶 丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X
Pepstatin 胃蛋白酶抑制剂 抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳 酶、许多微生物酸性蛋白酶
EDTA-Na2 金属蛋白酶抑制剂
NaF氟化钠 丝氨酸、苏氨酸磷酸酶
Na3VO4原矾酸钠 酪氨酸磷酸酶

电泳凝胶的制备:

蛋白分子量 (kDa) 凝胶浓度 (%)
4-40 20
12-45 15
10-70 12.5
15-100 10
25-200 8

内参对照:

内参名称 分子量大小 适用范围
Beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞
GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞
Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞
VCDA1/Porin 31kDa 线粒体
COXIV 16kDa 线粒体
Lamin B1 16kDa 细胞核(不适于去除核膜的样本)
TBP 38kDa 胞浆和全细胞

转膜:

- PVDF 膜 NC 膜 尼龙膜
灵敏度和分辨率
背景 较高
蛋白结合能力 100-200μg/cm2 (适用于SDS 存在时与蛋白结合) 80-100μg/cm2 大于400μg/cm2
机械强度 干的膜易脆 软而结实
溶剂抗性
浸润 100% 甲醛 缓冲液 缓冲液
适用染色方法 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 不能用阴离子染料
适用检测方法 显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测 显色法、化学发光、荧光、放射性 显色法、化学发光、放射性
适用范围 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测 普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1μm膜适用于70KDa以下蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
价 格 较低

显色:

底物 DAB 4-CN AEC TMB
稳定性 一般 避光
灵敏度 250pg 1ng   100pg
背景 一般
终产物成像性 成像较难 容易成像   容易成像
颜色 褐色 介于蓝色与蓝紫色之间(可用于双染) 棕红色 蓝紫色
毒性 有(疑有治癌作用)

 

选择R&D Systems 抗体的四大理由:
     1、Purification-采用抗原亲和纯化的方式对抗体进行纯化,纯化后的抗体具有更好的特异性;

     2、Antigens-使用重组蛋白作为制备抗体的免疫原,大大提高了抗体对抗原的特异性识别能力;

     3、Specificity-批次间稳定性的严格控制,有效保证了R&D Systems目录抗体在识别抗原时的特异性;

     4、Source-多种宿主来源,以及多种单抗或多抗的选择,为客户提供了更丰富、更贴心的选择。

 

R&D Systems全国授权代理—优宁维公司
 

上海优宁维生物科技股份有限公司

抗体专家 | 流式专家 | 免疫组化专家 | 实验服务专家 | 科学仪器

免费热线:4008-168-068    咨询邮箱:info@univ-bio.com   微信平台:优宁维抗体专家  

上海优宁维生物科技股份有限公司

试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链

免费热线:4008-168-068

咨询邮箱:info@univ-bio.com

订购商城:www.univ-bio.com

微信公众平台:优宁维抗体专家,欢迎关注!

小优博士(小程序):5大课堂, 让你的科研不再难!

公众号
小程序