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手把手课程之IHC关键操作步骤,本期品牌:CST

首发微信公众平台:优宁维抗体专家

本文重点讲述IHC操作流程中的关键步骤,并提供数据以支持及解释CST在实验过程中所提的建议(石蜡切片)。最后,本指南列出了CST 科学家内部常用且最适用于与抗体配套使用的IHC试剂

 

抗原修复—热诱导的抗原表位修复 (HIER)


缓冲液

适用于HIER 的缓冲液有多种。而CST 常推荐的两种缓冲液是:pH6, 10mM 柠檬酸盐缓冲液和pH 8, 1mM EDTA 缓冲液。缓冲液是否适用于您的实验取决于您所使用的一抗。请查阅产品说明书中所推荐的用于特异性抗体的修复缓冲液。一般而言,EDTA 缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体,而柠檬酸盐缓冲液适用于其他多数抗体。每天都需制备新鲜的1X溶液。

 

煮沸装置 

载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后,才可引起抗原修复。该步骤通常在微波炉或高压锅中进行。虽然,一些研究人员也使用水浴锅,但是,因为该步骤中所选择的装置对染色存在积极或消极的影响。所以,我们建议使用微波炉或高压锅加热煮沸以达到最佳抗原修复效果。

免疫染色

封闭 

在IHC–P中,我们建议在室温下在含有Tween20 的TBST 缓冲液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封闭样品,时长1小时,以防止非特异性背景染色。

在进行IHC–F时,在含有 0.3% Triton. X–100 的1X TBS 和 5% NGS 中封闭样品。市售的含有酪蛋白的封闭溶液与磷酸化的一抗结合后易减弱信号;因此,我们建议不使用含有酪蛋白的封闭剂进行磷酸化特异性抗体的检测。

以上针对封闭步骤所提建议均是在以SignalStain. Boost IHC Detection Reagent 作为检测试剂的情况下提出的。如果选择使用其他检测试剂,我们则建议使用与二抗来源相同的血清进行封闭。

 

一抗孵育

抗体稀释液 

在IHC–P中,有多种抗体稀释液可供选择,但是所选择的抗体稀释剂对染色效果具有显著影响。在CST,我们利用SignalStain.抗体稀释液、TBST/5% NGS(含5%山羊血清的TBST)或者 PBST/5%NGS(含5%山羊血清的PBST)来稀释一抗。因为合适的稀释剂具有抗体特异性;因此,查阅产品说明书中针对使用的抗体所推荐的稀释剂。在进行IHC–F过程中,一抗应在封闭缓冲液(TBS/0.3%Triton. X–100/5% NGS)中稀释。

检测

检测系统 

传统的IHC 检测方法利用了亲和素和生物素间的天然亲和性。这种亲和素–生物素–复合物 (ABC) 系统需要进行两步法检测:包括结合生物素化二抗后暴露于亲和素–HRP 复合物,然后进行显色反应。基于生物素的系统容易导致背景染色,特别是含有大量内源性生物素的肝脏、肾脏等组织。

因此,我们建议使用基于聚合物的检测系统,如SignalStain. Boost IHC 检测试剂。该基于聚合物的检测系统不含生物素,而包含了直接偶联于聚合物主链上的酶和二抗。

SignalStain. Boost IHC 检测试剂具有高敏感性并消除因内源性生物素所致的假阳性染色,其检测过程省去一个步骤为检测过程节省了时间,并且其与所有基于过氧化物酶的底物相容。

色原

二氨基联苯胺 (DAB) 底物是基于过氧化物酶检测系统中最常用的色原之一。DAB 与HRP 反应以在抗体结合处形成棕色沉淀物。在实验中建议始终使用高质量的DAB 底物。

在CST 公司,IHC 小组的CST 科学家内部鉴定IHC 抗体所使用的都是SignalStain. DAB底物试剂盒。SignalStain. DAB 底物试剂盒敏感性高,且与一抗的作用效果最佳。在TBST 中清洗 3 x 5 分钟(若为IHC–F,则在TBS 中清洗 3 x 5 分钟),以清除未结合的二抗,随后将 100–400μl SignalStain. DAB 应用于每一个组织切片并密切监控以得到合适的显色。

 

一般而言,1–10 分钟即可获得可接受的染色强度。获得合适的染色强度后,将载玻片置于蒸馏水 (dH2O) 中以阻止进一步显色。

CST的IHC/IF明星产品推荐

 

生化试剂:

Catalog Number Product Name Product Type Size Application
11932S Image-iT® FX Signal Enhancer Buffer 10ml IF-P IF-F IF-IC
12388S BackDrop® Green Background Suppressor Buffer 2.5ml IF-IC
14177S SignalStain® Mounting Medium Buffer 60ml IHC-P
14746S SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) Buffer 125ml IHC-P
14747S SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) Buffer 125ml IHC-P
15019S Animal-Free Blocking Solution (5X) Buffer 25ml W IHC-P
5425S Normal Goat Serum Buffer 10ml IHC-P IHC-F IF-P IF-F IF-IC ICW
8112S SignalStain® Antibody Diluent Buffer 25ml IHC-P
8961S ProLong®Gold Antifade Reagent with DAPI Buffer 10ml IF-P IF-F IF-IC
9071S ProLong®Gold Antifade Reagent Buffer 10ml IF-P IF-F IF-IC

 

检测试剂盒:

Catalog Number Product Name Product Type Size Application
8059S SignalStain® DAB Substrate Kit Detection System Kit 1Kit IHC-P
12692S SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit IHC Kit 1Kit IHC-P
65713T PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel IHC Kit 1Kit mIHC
78701T PD-L1, FoxP3, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel IHC Kit 1Kit mIHC
8109S SignalStain® Proliferation/Apoptosis IHC Sampler Kit IHC Kit 1Kit IHC-P

 

 二抗:

Catalog Number Product Name Product Type Size Application
4408S Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F HCA
4409S Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC HCA
4410S Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F
4412S Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F
4413S Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC HCA
4414S Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F
4416S Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 488 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F
4417S Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 555 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC
4418S Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 647 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F
8114S SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) Secondary Antibody 15ml IHC-P
8125S SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) Secondary Antibody 15ml IHC-P
8889S Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F
8890S Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) Secondary Antibody 250µl IF-IC F

 

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