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外泌体研究如何因地制宜(RnD systems)

 本文转载自公众号:RnDSystems


【外泌体研究热点】 ————————————————————————————————————————————


     外泌体是近年的研究大热点,2007 年 Valadi 等首次系统阐述了外泌体包含功能性的 mRNA 和 microRNA,让科学家认识到背后蕴藏着强大的调控功能;而后外泌体与肿瘤相关研究迅速增加,2011 年后更是激起了爆炸式的外泌体研究热潮。

 



随着研究的进展,外泌体的重要功能不断被发现:


     1)参与重要的细胞间通信过程,包括免疫应答、抗原提呈,肿瘤侵袭、新生血管等;为生物大分子和病原微生物提供重要的传递途径。


     2)作为疾病诊断的依据,外泌体的类型和水平,以及携带的蛋白、脂类、mRNA、miRNA、DNA 可以作为生物标志物。


     3)外泌体对内容物能起到很好的保护作用,被用作药物载体,本身携带 MHC-抗原肽复合物,可增强免疫反应,并可以穿过血脑屏障。


     哟,这真是个激动人心的方向,听起来可以出大文章,将来大展身手的样子。且慢!外泌体研究可没那么简单,所有真核细胞都可以分泌外泌体,所有体液中都包含有外泌体;除了进行细胞间通信外,它们还负责清扫细胞内的「垃圾」;研究外泌体还得把它与其他细胞囊泡相区分;因此分离、鉴别外泌体,并进行相应研究是一门大学问。


【分离技术】 ——————————————————————————————————————————————


     有多种技术可用于外泌体的分离,它们利用外泌体的特征,如密度、形状、大小和表面蛋白标志物来帮助其分离。主要方法的对比见下图:


整理自文献,DOI:10.7150/thno.18133



     目前作为外泌体分离金标准的方法还是超速密度梯度离心,但它耗时耗力,一般每次最多只能处理 6 个样品,且需要的样本量大。其他方法由于其各自的优势也被越来越多地得到应用,这里要特别讲一下免疫亲和捕获的方法上表中已经介绍了方法的原理和它最大的优势「特异性」,我们来看一下它在具体应用中的价值:


     基于免疫亲和开发的 ELISA 试剂盒可以实现样本中外泌体的捕获、检测并定量分析。对已知标志物的外泌体,分离后可用它进行快速的产率和特异性分析。包括血浆,血清和尿样都可用来作为检测样本。



     同样基于微孔板的免疫亲和捕获产品,用于外泌体捕获,得到的结果和超速离心的非常接近,而所用样本体积少得多,特别在 RNA 得率上还要高于超速离心。此类产品还有免疫微球等可供选择。


     基于免疫亲和技术的快速自动化处理技术被应用于高通量蛋白质组研究,比如以 CD91 作为标志物的肺癌相关外泌体的质谱分析。由于高特异性,用其他方法分离的外泌体可以通过免疫亲和捕获进一步进行纯化,然后再进行下游的 RNA 提取,为癌症等疾病的筛查提供更可靠的检测手段。


【外泌体特征】  ————————————————————————————————————————————

 

     生成普通微囊泡的外出芽方式不同(下图左上),外泌体形成于早期胞内体,在内吞体转运复合体(ESCRT)及一些相关蛋白的调控下,早期胞内体发生内出芽形成多个腔内小囊泡,构成多胞体(MVB),MVB 最后在 GTPase 家族中的 RAB 酶调解下与细胞膜融合向外界释放囊泡。(下图左侧流程示意)



外泌体形成和分子组成图示,来自 Novus 官网


     外泌体的表面蛋白标志物主要包括:四次跨膜蛋白家族成员 CD63、CD81、CD9 等,它们是鉴定外泌体的经典标志物;其他的蛋白标志物还有 Alix、flotillin、TSG101、Rab5b。此外,外泌体内还含有多种核酸标志物,包括 DNA、mRNA、miRNA、vRNA、lncRNA 等。(更多信息见上图右侧图示)。


     和其他胞外囊泡结构相比,外泌体体积最小,直径 30-100nm,蛋白质和脂质的组成不同于其他类型。外泌体的浓度可达 3x106/mL,存在于血液、唾液、尿液、乳汁和其他体液中。在密度梯度离心中位于 1.15-1.19 g/mL 的蔗糖密度梯度中。


来自 Tan A, Rajadas J, Seifalian A M. Advanced drug delivery reviews, 2013, 65(3): 357-367.


     外泌体携带的一些重要蛋白可以作为细胞和疾病特异性生物标志物,在研究过程中可选择合适的免疫检测方法对它们进行研究。在不同的细胞类型和生物学过程中,外泌体内容物有各自的鲜明特点:


免疫细胞外泌体特异性标志物,来自 R&D Systems 官网


干细胞外泌体特异性标志物,来自 R&D Systems 官网


神经细胞外泌体特异性标志物,来自 R&D Systems 官网


癌症和其他疾病相关外泌体特异性标志物,来自 R&D Systems 官网



     确定外泌体来源和其标志物组成对分析癌症和其他疾病的进程具有重要意义,上面这些生物标志物恰恰是关键的分析目标,由于样品的标志物组成一般都具有多样性,因此多因子高通量分析技术在外泌体研究中承担了重要的使命。


【外泌体研究工具】 ————————————————————————————————————————————


     外泌体研究中,R&D Systems 的兄弟品牌 Novus 在分离、纯化、鉴定、定量分析、RNA 提取等方面提供了一系列的产品,更有全面的抗体产品线满足您流式细胞分析,免疫组化/ICC/IF 等应用,还提供各类外泌体标准品供对照使用:

 

 
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