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激酶药物筛选(HTRF法)



HTRF 原理

HTRF(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)技术基于时间分辨荧光( time resolved fluorescence TRF)和 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer FRET)两大技术原理。

时间分辨荧光 (TRF)利用稀土元素中镧系元素的独特性质。它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级,镧系元素的半衰期是毫秒级,有6 个数量级的差别。所以,在检测时,TRF 有一个时间延迟--50微秒。经过这个时间延迟,普通荧光的信号几乎为零。所以,TRF 的背景非常低, 反映样品的实际情况。

 

荧光共振能量转移(FRET)技术利用了两种荧光基团的能量转移,这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)Donor 被外来光源激发(例如氙灯或激光), 如果它与Acceptor 比较接近,可以将能量共振转移到Acceptor上,使其受到激发,发出特定波长的发射光。

 

Donor Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合,生物分子的结合可以将Donor Acceptor 拉到足够近的距离,产生能量转移。由于Acceptor 的发射光来自于能量转移,所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开,即不需要洗涤步骤。

 

HTRF 的能量供体

HTRF 的能量供体是铕(Eu)和铽(Tb)的穴状化合物。在这个穴状化合物里,Eu Tb 被永久地嵌合在一个笼子里,结构非常稳定。这个结构是由 J.M. Lehn’s 教授发明的,并由此在1987 年获得了诺贝尔奖。

HTRF的能量受体

HTRF的能量受体也有两种,XL665d2。它们的光学性质相同,分子量不同。前者分子量为105 KD,实际上就是别藻蓝蛋白(APC)。我们将APC的亚基偶联在一起,使其不能解离,提高了稳定性。后者分子量为1 KD, 在某些实验中有独特的优势。

 

HTRF的操作步骤

HTRF的操作步骤非常简单,只需要将实验所需试剂加进去,然后孵 育、检测即可。

 

HTRF的应用

G蛋白偶联受体研究:受体第二信使检测受体配体结合胞内信号分子检测

激酶活性检测:胞外激酶活性检测胞内激酶活性检测

生物标志物检测:基于抗体的夹心法和竞争法检测

抗体检测:抗体重链含量测定、抗体轻链含量测定

生物过程分析:GST含量测定、HIS含量测定、CHO宿主蛋白含量测定

免疫过程分析:CD16结合检测、CD32结合检测、CD64结合检测

相互作用分析:蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-DNA、蛋白-RNA

蛋白修饰:蛋白甲基化、蛋白乙酰化、蛋白泛素化、蛋白水解

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