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流式细胞术疑难解答（二）：背景荧光（非特异性染色）高

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背景荧光高（即非特异性染色明显）可能是多种因素造成，例如荧光素、抗体、标记方法、仪器、其它试剂或数据分析等。在此，我们对这些因素进行一一解析，让大家能够充分了解背景荧光的来源，从而能够在实验中针对性的去解决。

1、自发荧光

不同细胞和组织，以及培养基添加物，都有不同水平的自发荧光。自发荧光主要的来源包括NADH、核黄素、黄素辅酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交联、某种生物结构（如线粒体、溶酶体等）。粒系细胞特别容易出现自发荧光，因为这些细胞内的蛋白和分子更容易在低波长时被激发（例如紫外、紫光和蓝光），发射波长大约在500~700nm，与一些常见的荧光素（如FITC、PE）重叠。所以对这类细胞应该记得用未染色的空白对照检查一下自发荧光水平。

另外切记，直方图上看不出自发荧光群，只有通过散点图才能看出自发荧光群体并将它圈出，如下图中所示FL-1（GFP）和FL-2散点图查看GFP表达细胞，直方图看到两个峰，但无法区分自发荧光，而散点图则可轻松圈出自发荧光群体（AF）。

2、稀释

抗体用量是否合适？尽管厂家会有推荐的抗体用量，但要记得使用前进行抗体滴定，以了解最佳用量。优化后的抗体用量可以帮助你最大程度地减少背景荧光并提高信噪比。

3、补偿高

如果两个或更多的荧光素之间发射谱重叠，那么就需要调节补偿以消除相互间的影响。不过，调节补偿前，首先需要电压值调节到合适的值，否则会导致补偿异常增大。例如下图中，BV510™和BV570™之间由于相互渗漏存在补偿，如果BV570™的电压被BV510™的电压明显高，那么会导致补偿过大（下图左侧），如果PMT电压调节到合适值，那么他们的补偿就非常好调了（下图右侧）。

所以，有时候你的背景荧光高很可能是由于电压没有调好的问题。

4、代谢活化

背景荧光增高也可能由于代谢活化引起。例如在PMA活化的PBMC中染IL-17A时，从FMO对照中明显看出BV421™通道基线的上升，这可能由多个因素引起，包括自发荧光增高和其它荧光素的渗漏增大引起。

5、花青素染料

花青素染料和一些相关串联染料很容易结合到Fc受体，尤其是单核细胞。这种反应无法通过Fc受体阻断剂阻断，其确切原因未知。如果你在研究髓系细胞中的一个群体，建议还是用其它类别的荧光素。

6、细胞碎片

你有没有用活性染料来确保分析时都能分析到活细胞？细胞碎片、死细胞可导致高背景染色，所以在设门时，切记要排除掉碎片。一般情况下，碎片在FSC/SSC散点图中位于最左下方。

7、活性

如果分析时不小心设门将死细胞/碎片圈进了，就可能会出现一些假阳性。所以用PI或7-AAD甚至一些更好的活性染料，能够很好的排除死细胞。

DAPI也可以用来区分死/活细胞，它也能够透过活细胞膜，但效率很低。下图显示了DAPI+细胞群和DAPI-细胞群之间CD45/CD11b散点图的区别。

8、Fc阻断

Fc受体表达在很多细胞表面，包括粒细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞。它们很容易结合抗体的Fc部分，从而导致结果假阳性。为了这种背景荧光，推荐使用商品化的Fc受体阻断剂或相应物种的血清。

9、FMO/同型对照

同型对照是为了帮助确定目的抗体非特异性背景染色（针对Fc受体或胞内蛋白结合）而设置的阴性对照。FMO（荧光扣从对照）相对来说在抗原表达弱、或者进行多色流式实验的时候更适合，它可以反映你的抗体组合中其它通道荧光的渗漏，帮助你选择正确的阳性群体。

如果你要使用同型对照，记得一定要选择与目的抗体相同量的同型抗体。例如你使用1ug CD4，那么就要使用1ug同型对照。

避免从不同公司购买同型和目的抗体，因为不同的公司，其抗体荧光素：蛋白（F：P）比例是不同的。

10、粘连体

粘连体通常发生在细胞之间粘附在一起或分裂过程中。粘连体给流式细胞术分析带来了困难，因为粘连体通过检测点时，检测装置仍然认为它是一个信号。所以如果没有在分析时设门排除掉粘连体，那么就可能对结果造成误读。

在流式缓冲液中加入EDTA，并且将标本通过30um过滤，可以使粘连体大大减少。

粘连体还可以通过散点图的W/H或W/A设门排除。如下图，（1）代表单个细胞群，（2）代表粘连体，两种群体的结果明显不同。

11、串联染料降解

如果你使用的是串联染料，那么如果抗体保存不当或者没有避光，那么就可能发生降解。在下图的例子中，左图是正常的PE-cy5检测结果，可以看到FL2没有信号，但PE-cy5染料在光照后降解，右侧图就可以明显看到FL2（PE通道）也能检测到很强的信号。

串联染料对某些固定方式也很敏感，所以如果在固定后检测发现背景荧光异常，那时也需要考虑是否由于固定剂引起。

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