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支原体污染了怎么办?

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随着现代医药生命科学的发展,细胞培养也成为生物技术和生物医学研究领域(如生物制药,疫苗研发,细胞治疗及诊断领域)必不可少的工具。不像其它常用的实验方法,细胞培养是一个动态的连续过程,一直有着支原体污染的困惑,常规细胞培养中支原体污染率约为35%以上,它们竞争营养并释放有毒的代谢产物,严重干扰实验结果的可信度。

你是否遇到过培养的细胞悄无声息的被毁掉了?

是否遇到过辛苦很久得出的实验数据不能重复?

选择快速简单高效的方式定期进行支原体的检测、消除和预防非常关键。




1.支原体到底是什么呢?


支原体是一种直径大小仅为0.1-0.3μm,无细胞壁,可轻松透过一般过滤膜混入培养系统中的最小最简单的原核生物,呈高度多形性,有球形、杆形、丝状,分枝状等多种态。它不同于细菌,也不同于病毒,种类繁多,分布广泛。

实验室常见的种类有:口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、人型支原体、唾液支原体、肺支原体和梨支原体等。

典型的支原体污染来源:

①细胞之间交叉污染;

②工作环境或实验器材的污染;

③实验者无菌操作不佳;

④培养基或其他试剂污染;

⑤制备细胞的原始组织或器官的污染;



2.支原体特性是什么呢?

  • 支原体体积很小,除非用Hoechst染色细胞否则无法在常规显微镜下观察到;
  • 支原体结构简单,依附于宿主细胞膜表面;
  • 支原体无细胞壁,青链霉素(双抗)对支原体无效;
  • 支原体污染会干扰很多生物学参数,从而影响实验研究的最终数据。






细胞被支原体污染后会引起:

细胞生长特征的改变,细胞代谢的抑制;

核酸合成的破坏,染色体畸变;

细胞膜抗原性的改变,并可能改变转染率和病毒敏感性。

但是细胞的生长率一般并未发生显著的影响,因而细胞被支原体污染一般难以察觉。

因此支原体的定期检测、及早发现及清除对细胞培养尤其是非常重要的细胞极为重要。



3.支原体检测方法

细胞培养中有几种不同的技术可以识别是否被支原体污染,分别是分离培养法,DNA荧光染色检测法,ELISA检测法,PCR检测法和支原体特异酶检测法。为给大家提供一个选择参考,小优这就详细介绍下这几种方法的优缺点。

分离培养法

操作方法:

从可疑的细胞培养体系中取样,并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体,它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长,最终形成明显可见的特征性菌落。

分离培养法是支原体检测的金标准方法,基本不会出现假阴性结果,其检测精确度最高,具有高度的特异性和敏感性,可检测绝大多数支原体种类。但支原体虽能在人工培养基上生长,但对培养基的营养要求较高,培养基较为复杂。而且检测时间太长,支原体要长出明显克隆至少需要4周时间,若检测到有支原体,细胞的污染范围也已经扩大了,现在用此方法检测的比较少。


 
DNA荧光染色检测法

操作方法:

1、细胞样品的准备: 

(1)对于贴壁细胞,在六孔板或其它多孔板内或盖玻片上培养细胞至 50%-80%。细胞培养过满会导致很难判断是否存在支原体污染。 

(2)对于悬浮细胞,离心沉淀细胞,取少量细胞做细胞涂片,空气中充分晾干。 

2、用 PBS 按照 1:10 稀释 Hoechst 染色液(1 体积 Hoechst 染色液加入 9 体积 PBS)。稀释后的 Hoechst 染色液宜在 24h 内使用。 

3、加适量固定液固定 10~20min。 对于六孔板的一个孔,加入 1mL 固定液。确保固定液充分覆盖样品,固定前切勿对细胞进 行洗涤。对于贴壁细胞,固定前需去除培养液。 

4、去除固定液,空气中晾干。 

5、加适量 10 倍稀释的 Hoechst 染色液室温染色 10~30min。 对于六孔板的一个孔,加入 1mL 染色液。确保染色液充分覆盖样品,染色时注意避光。可以用铝箔纸避光。 

6、去除染色液,空气中晾干。 

7、滴加试剂盒中提供的抗荧光淬灭封片液,封片后荧光显微镜下观察蓝色荧光。 荧光显微镜观察时需 400 倍或 1000 倍放大观察(需使用油镜)。 没有支原体污染或其它原核生物污染的细胞样品,仅观察到细胞核的蓝色荧光,线粒体 DNA 不会被染色。 

有支原体污染的细胞样品可观察到细胞核周围微粒状或丝状蓝色荧光。 支原体污染严重的细胞可以观察到大量微粒状或丝状蓝色荧光。

培养细胞中的细菌污染、酵母污染或霉菌污染都在光学显微镜下可见,但支原体污染在光学显微镜下不可见,通过Hoechst染色来检测支原体,可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。但是Hoechst 染色试剂对人体有害,要注意防护;且固定液含有冰乙酸,有刺激性气味,需要在通风橱内进行固定操作;荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽量当天完成检测。


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货号 名称
abs9252-100T 支原体染色检测试剂盒


ELISA检测法

以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体,也有一些商品化的支原体elisa试剂盒来检测培养物中是否含有支原体。不过这种方法相对复杂市面上用的也比较少。

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货号 名称
abs150039-100ul 支原体鼠单抗
abs150125-100ul 支原体鼠单抗鼠单抗,HRP标记

 

PCR检测法

PCR法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本,可扩增样品中DNA的特定序列,其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中,支原体DNA会显示为特异性条带,以此指示支原体的存在。

PCR检测法是一种灵敏而快速的方法,可以在4.5 h–1天内识别细胞培养物中的支原体污染,在细胞培养实验室也广泛使用。但是,存在在测试过程中将污染物从阳性对照(或以前对支原体测试呈阳性的任何样品)传播到未受影响的样品的风险,从而导致假阳性结果,许多商品化的试剂盒也无法检测所有种类的支原体。另外PCR的扩增会被细胞的代谢产物抑制,需要用DNA提取试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。 


支原体特异酶检测法

操作方法:

1、取2mL培养基上清(建议培养48小时以上),200g离心5分钟,去除细胞和细胞碎片;

2、取100μL上清,加入100μL裂解试剂(MycoAlert PLUS Reagent,含裂解试剂、荧光素酶、荧光素),裂解支原体;

3、室温22℃(不超过25℃)孵育5分钟,检测背景ATP,测量发光值得到读数A(Reading A);

4、加入100μL支原体酶特异性底物(MycoAlert PLUS Substrate);

5、室温孵育10分钟,测量发光值得到读数B(Reading B),计算B/A比值。

若B/A比值小于0.9则为支原体阴性,若B/A比值大于1.2则为支原体阳性,若介于两者之间则为结果可疑,需要继续培养24h后复检。

支原体特异酶检测法主要是Lonza品牌的MycoAlert™方法,首先溶解支原体细胞,释放其酶。这些酶与试剂盒中的底物发生反应,催化ADP向ATP的转化。萤光素酶使用此ATP来创建光信号,然后可以使用发光计对其进行检测,通过检测底物加入前后读数的比值,可判断样本中是否含有支原体。

该法为化学发光,操作简单,无需提取DNA,快速检测,20分钟内出结果,具有较高的灵敏度、特异性及相对较高的准确性,已验证可检测至少44种支原体,包含细胞培养中最常见的6种支原体(口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾原体、发酵支原体、唾液支原体,占支原体污染的95%),既可以检测新鲜样本也可以检测冻存样本,可以视为常规微生物培养和DNA荧光染色法的替代方法。


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货号 名称
LT07-318 MycoAlert™ 支原体检测试剂盒
LT07-710 MycoAlert™ PLUS 支原体检测试剂盒(更灵敏)
LT07-518 MycoAlert™  支原体检测阳性对照
AAL-1002 LucettaTM 2 Luminometer光度计

    

最好的测定方法必然是高灵敏、高特异性且快速的。但目前没有一种非常完美的检测方法可以单枪匹马把实验室污染细胞的八种主要支原体都检测出来。大家可以根据自己的实验需求选择相应的产品,也可以结合使用两种方法对支原体进行鉴定以获得最可靠的检测结果。



4.支原体清除

当发现细胞中存在支原体污染后,如果是不太重要或者有备份的细胞,可将培养物与用过的培养基灭活后丢弃即可。但对于珍贵的细胞就要选择支原体清除试剂来处理细胞,并结合抗生素以彻底清除支原体来拯救比较重要的细胞样品。

这里推荐Lonza的MycoZap广谱支原体清除试剂,使用简单,只需将支原体清除试剂加入培养基中,细胞毒性小,不影响细胞正常生理状态,可在4天内去除大范围支原体、无胆甾原体、植物花螺原体等柔膜菌纲物种;随后的4-6周内,可以再用Lonza MycoAlert支原体检测试剂盒进行不间断检测,以确保后续培养物不被污染。


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货号 名称
LT07-818 MycoZap 支原体消除试剂(1处理),4天内消除
LT07-918 MycoZap 支原体消除试剂(5处理),4天内消除
abs9375 支原体清除剂,可替代双抗,7天左右清除
VZA-2031 MycoZap 抗生素(10 mL)




5.支原体预防

支原体非常顽强,尽管有可清除的试剂,对支原体污染的预防工作也是非常有必要的。主要可从以下几个方面:

首先规范细胞培养技术始终是预防支原体感染的最佳方式,如细胞培养工作中多注意控制环境污染、严格实验操作、细胞培养基和器材要保证无菌以及在细胞培养基中加入适量的抗生素等;

其次搭配使用预防试剂,如Lonza MycoZap支原体预防试剂特异性预防支原体污染的抗生素,其中MycoZap Plus可预防包括支原体、革兰氏阳xing菌、革兰氏阴性菌、真菌、酵母在内的多种微生物污染,其配方也根据细胞系、原代细胞进行了特殊优化。

最后定期检测也很重要,支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎,将定期支原体检测常规化坚持下去,也是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

建议检测频率

新细胞进入实验室 必检
液氮保存前 必检
定期常规  每月检测一次
发现污染后  每周检测一次
发现细胞异常 随时检测

 


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VZA-2011 MycoZap Plus-CL(细胞系)
VZA-2021 MycoZap Plus-PR(原代细胞)
abs9376 支原体预防剂


谈到支原体污染,小优还特别邀请到了Lonza资深应用技术专家做一场线上讲座:

主题:支原体对细胞实验的危害及快速检测方法介绍

时间: 2021.6.7 周一16:00-17:00

地点:小优博士(小程序)

方式:直播+回放,可预约提醒

讲座主要内容

  • 什么是支原体污染,支原体污染对实验影响的统计情况

  • MycoAlert快速支原体检测方法介绍

  • 搭配Lucetta2.0的支原体检测实验流程

 

除了支原体污染相关的讲座,近期小优携手Lonza品牌开展了一系列的线上讲座,敬请关注。

更多支原体检测,清除及预防相关问题可联系优宁维。

 


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