【小优细节君】偶遇Caspase提问器
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【小优细节君】偶遇Caspase提问器

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上期小优细节君聊了下如何做好NRF2,没想到反响还不错,很多老师说对他们的实验很有帮助。最近又碰到一个老师对Caspase很有兴趣,Caspase相信大家都不陌生,凋亡刽子手、炎症之友,但熟悉不一定好做,尤其是剪切体的Western。下面就让我们一起看看细节君是如何见招拆招的。


Q:细节君,老板让我最近看看Caspase,你给我讲讲呗。

A:Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase),能够特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键。现已发现的哺乳动物细胞Caspase家族成员共15种,他们有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。

Q:那这15种Caspase蛋白有什么区别?

A:由于Caspase可自我活化并能相互激活,因此凋亡过程一旦触发,即呈级联放大效应。根据Caspase在级联反应上、下游的位置及功能的不同,可分为三大类:

第1类为凋亡始动子,位于级联反应上游,包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,该类蛋白酶的氨基端有一段特殊结构域,如Caspase-2,-9上的CARD结构和Caspase-8,-10上的DED结构,使其可与具备同源结构的衔接蛋白结合并发生聚集, 进而引发自身激活并激活下游的Caspase。

第2类为凋亡效应子,位于级联反应下游,包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7,该类蛋白酶在受到起始凋亡蛋白酶的切割后被激活,活化后的效应凋亡蛋白酶通过对维持细胞结构及生命活动所必须的蛋白进行一一裂解,导致细胞结构的破坏及DNA损伤断裂,最终引起细胞死亡。

第3类包括Caspase-1、Caspase-4、Cas-pase-5、Caspase-11、Caspase-12,主要参与细胞因子介导炎症反应并在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。

Q:你刚说的活化是什么意思呢?

A:Caspase家族通常以无活性的蛋白酶原形式,酶原分子量在30-50 KD之间,由NH末端区、大亚基(P17-20)、小亚基(P10-12)及连接大小亚基的连接区组成。Caspase酶原分子激活后,大小亚基解离并重新组装异源二聚体,再由两个二聚体组成有活性的四聚体。

Q:Caspase家族有这么多,我该如何开始做呢?

A:建议可以先观察Caspase-3的变化,Caspase-3在细胞凋亡中是关键的执行者。Caspase-3一旦被激活,即发生下游的级联反应,使凋亡不可避免,对许多关键的蛋白起着部分或全部的裂解作用,如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)及众多细胞骨架相关的蛋白,因而Caspase-3也被称为“YAMA”(阎罗王)。


Q:那Caspase-3是如何活化的?

A:正常情况下,细胞中的Caspase-3以无活性的酶原形式存在,细胞凋亡信号的出现可导致Caspase-3(32kDa)前体转变为成熟体,成熟的Caspase-3由亚基p17(17kDa)亚基p12(12kDa)组成。

Caspase-3前体的裂解位点为ESMD2S(氨基酸25-29)和IETD2S(氨基酸172-176)。Caspase-3从前体Caspase-3转变成成熟Caspase-3分两个步骤形成,首先在IETD2S位点被切割,产生p12亚基和20kDa(p20)肽,接着p20在ESMD2S位点被切割,产生成熟的p17亚基。

Q:为什么有的组织检测不到Caspase-3?

A:Caspase-3 在一些组织中的蛋白表达较低,很难检测到,例如大脑皮层平滑肌骨骼肌等。其实这个也可以理解,这个和每个组织本身的凋亡水平是密切相关的。

Q:为什么western只能检测到Caspase-3的前体,检测不到剪切体呢?

A:最关键的原因是凋亡诱导的成功与否。

如果是做经典模型,要多参考文献中的条件设置;

如果是探索性的实验,务必要设置药物诱导时间和浓度梯度的预实验,来确定特定细胞系中诱导Caspase-3 活化的最佳条件。

如果不确定药物是否可以诱导,强烈建议加入阳性对照,可以参考CST使用依托泊苷(25 uM for 5 hours)或十字孢碱(1uM for 3hours)处理的Jurkat、NIH/3T3细胞。


↓下图是某位老师自己的样本和处理方式与CST阳性对照的对比结果图,也验证了细胞系和诱导处理方式是做出Caspase-3剪切条带的关键因素。

Q:我做的是贴壁细胞,要不要收集上清中的细胞?

A:细胞发生凋亡后会变得难贴壁,需离心收集所有的悬浮细胞。

Q:其他western步骤还有没有什么需要注意的呢?

A:
1. 裂解样本的时候要超声,使目的蛋白溶出更加充分,这点在做其他靶标也是一样的。
2. 保证足够的蛋白上样量,组织样本推荐50~100μg,细胞样本推荐20~50μg。
3. Caspase-3 剪切体分子量较少,注意转膜时间不能太久,避免过度转膜,同时膜要使用0.22μm。

Q:我好不容易做出剪切体条带了,但是趋势不对,是什么原因呢?

A:做的趋势不对的时候,也别急着怀疑自己或者怀疑试剂的问题,可以顺着现象去探索问题的本质,很多出色的研究就是在“违背”我们所认为的常理中发现的。

例如在癌症治疗中,细胞凋亡是一种公认的细胞死亡机制,细胞毒性药物通过它来杀死肿瘤细胞。但是在这篇研究中《Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy》,作者发现快要死亡的肿瘤细胞利用凋亡过程中产生的强有力的生长刺激信号来重新生长,进一步深入发现Caspase-3作为凋亡的执行者,竟然还在生长刺激中起着关键作用。所以说,任何不寻常的可重复的可靠实验结果都值得我们认真对待。

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