HTRF®技术助力新冠病毒SARS-CoV-2 S1/ACE2抗体筛选
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HTRF®技术助力新冠病毒SARS-CoV-2 S1/ACE2抗体筛选

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SARS-CoV-2基因组共有30kb,是具有完整包膜和冠状链的ssRNA病毒,是目前已知的最大的RNA病毒。基因组学研究提示,SARS-CoV-2病毒主要分为3个功能区:ORF1a/1b非结构多蛋白,由16个小蛋白组成,参与病毒复制;结构蛋白,包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳(N),其中刺突蛋白的细胞受体是ACE2(血管紧张素转换酶抑制剂2),参与人体细胞锚定;辅助蛋白ORF3-10在SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在差异,可能参与编码修饰细胞先天性免疫应答。
 
刺突蛋白(Spike)是与宿主细胞结合的关键结构域,介导受体结合和膜融合,对决定宿主的感染性和传播能力至关重要。冠状病毒的刺突蛋白在功能上分为S1结构域,负责受体结合,以及S2结构域,负责细胞膜融合,其中的S1亚基包含受体结合域(RBD),刺突蛋白中的受体结合域是冠状病毒基因组中变化最大的部分。刺突蛋白也是目前抗病毒药物和疫苗研究的重要靶点。
 
在20世纪初的时候Donoghue发现了一种与人类ACE相关的羧肽酶,它是由805个氨基酸组成的I型膜结合糖蛋白,其活化位点位于第374-378位氨基酸残基上,形成一个HEXXH锌结合区,后来我们称之为ACE2,即血管紧张素转化酶2。ACE2的生理作用是调节血管紧张素的状态。它是一种能催化血管紧张素I转化为血管紧张素II或血管紧张素II转化为血管紧张素1-7的外肽酶。
ACE2以二聚体形式存在,同时具有“开放”和“关闭”两种构象变化,可同时与冠状病毒的两个S蛋白三聚体结合。全长ACE2由一个N末端肽酶结构域(PD)和一个C末端Collectrin样结构域(CLD)组成,CLD末尾包含单个跨膜螺旋和一个有约40个残基的细胞内节段。2种构象的转换是通过ACE2上蛋白酶结构域(PD)的旋转实现的,而PD正是冠状病毒S蛋白的直接结合位点,也就是病毒感染人体的入口。
来自弗朗西斯·克里克研究所的科学家,借助于冷冻电镜技术,记录下了新冠病毒S蛋白与其受体ACE2结合的10个重要瞬间。他们发现,新冠病毒S蛋白的受体结合域(RBD)一旦与ACE2结合,就会让S蛋白三聚体变得更不稳定,暴露出隐藏在三聚体下面、负责完成与细胞膜融合的S2三聚体。
 
刺突蛋白RBD区域是新冠病毒的重要靶标,单克隆抗体与ACE2肽段都可能阻断病毒受体结合,降低感染风险。然而小分子抑制剂相较于多肽、蛋白质,具有更好的生物相容性、溶解性,稳定性较高,生产成本也较低。Biophysical Journal 上的一项研究指出了两种潜在的小分子化合物可阻断RBD-ACE2结合及其作用机制。
 
基于ACE2靶点抗体的治疗策略
CR3022:2020 年 1 月 28 日,复旦大学应天雷等团队在 BioRxiv 在线发表题为Potent binding of 2019 novel coronavirus spike protein by a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody的文章。该文章首次报道了SARS特异性人单克隆抗体CR3022可与2019-nCoV RBD有效结合。在2019-nCoV RBD内,CR3022的表位不与ACE2结合位点重叠。因此,CR3022有潜力作为候选疗法进行开发,单独或与其他中和抗体结合,用于2019-nCoV感染的预防和治疗。
 
TMPRSS2抑制剂:2020年1月31日,德国莱布尼兹灵长类动物研究所Markus Hoffmann等人在BioRxiv 发表题为 The novel coronavirus 2019 (2019-nCoV) uses the SARS-coronavirus receptor ACE2 and the cellular protease TMPRSS2 for entry into target cells 的文章,证明2019-nCoV通过SARS冠状病毒受体ACE2进入人体,而细胞蛋白酶TMPRSS2用于2019-nCoV-S引入。TMPRSS2抑制剂阻止进入,可能构成治疗选择。最后,该研究显示了来自恢复期SARS患者的血清中和了2019-nCoV-S的进入。该研究结果揭示了2019-nCoV和SARS冠状病毒感染之间的重要共性,提供了治疗2019-nCoV病毒的潜在靶标。
 
HTRF®技术原理介绍
HTRF ®S1/ACE2结合试剂盒用于测量S1和ACE2之间的相互作用。利用HTRF(均相时间分辨荧光)技术,该检测方法能够实现:高通量、简单、快速地筛选化合物和抑制剂。
ACE2用Eu(HTRF供体)标记,S1用d2(HTRF受体)标记。当供体和受体因S1和ACE2结合而接近时,供体的激发触发向受体的荧光共振能量转移(FRET),受体在665nm处发射信号。这种特定的信号与S1/ACE2相互作用的程度成正比。因此,化合物或抗体阻断S1/ACE2的相互作用会导致HTRF信号的下降。


检测模型如下图所示
 
实验流程
HTRF®的检测全过程不需要任何的包被与洗涤,仅需在空板中加入待测物4μl,然后加入检测抗体各8μl,进行孵育后即可使用酶标仪进行读值。
 
检测结果展示
 
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HTRF S1/ACE2检测试剂盒
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64BDS1PEG S1/ACE2 BINDING ASSAY KITS 500 tests
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均相技术需要使用搭载有相应模块的酶标仪进行读值,优宁维推荐PE VICTOR Nivo™多功能酶标仪:
 
VICTOR Nivo™多功能酶标仪配置六种检测模式:分别是荧光强度、化学发光、吸光度(紫外线和可见光)、时间分辨荧光、荧光偏振、Alpha;同时模块化设计可选配分液器,自动进板系统和气体控制选件;并且为长时程细胞检测等需要临界温度的检测提供了温度控制功能(最高65度)


广泛应用于核酸/蛋白定量、ELISA、酶活动力学、GPCR、激酶检测、离子通道、线粒体膜电位、表观遗传学分析、分子相互作用、结合分析、凝集反应、报告基因检测、BRET测定、细胞活力、细胞增殖、细胞凋亡、细胞毒性、细胞膜的完整性和膜的溶解、细菌粘附、细菌鉴定、食品毒素、环境内分泌干扰物、激素检测等几乎所有涉及微孔板的实验与检测。 


体积小巧,放置于密闭操作空间内



VICTOR Nivo™的核心光路是一个旋转32位滤光片转轮。完全配置之后,系统可检测大量染料,且比光栅系统具有更好的灵敏度和更大范围的高信价比。具有以下特点:
•内圈及外圈转轮间可互换
•可任意用于激发或发射光路
•滤光片被锁在转轮中,不易丢失



•专用激光光源Alpha模块,仅需数分钟即可完成96和384孔板检测,同时还能够保持很高的信噪比,VICTORNivo™使几乎所有实验室都能够实现快速、高灵敏度的Alpha检测技术。

•对于长时间动力学检测的活细胞实验,为保证细胞活力及健康程度,您可以配置整合型温控模块(温度可高达65℃)气体控制模块。而且,您可以通过控制O2以适用于厌氧实验。该读板仪提供所有模式下的顶读&底读功能。底读模式常适用于贴壁细胞检测,其创新性光路设计更保证了底读检测的突出性能。



   

•当与载板架系统结合时,VICTORNivo™可以快速连续读取20块微孔板,您可通过设置无人值守自动化进板流程。

     
•对于在加样前后需要直接检测的实验,如闪光型化学发光快速动力学检测,您可以选配加样器模块。这种双注射器加样装置,可以检测萤光素酶双报告基因实验,如我们的Twinlite技术。可根据实验需要在每孔内加入小体积样品,随后同时进行检测。该系统非常方便进行初始化、清洗及维护,并且在自动加样以之前会自动检测孔板是否已放置到仪器内,以防止加样造成的系统污染。



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