膜蛋白纯化解决方案
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膜蛋白纯化解决方案

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膜蛋白是一种位于细胞膜上的蛋白,主要分为外周膜蛋白和跨膜蛋白两大类。膜蛋白具有重要的生物功能,如控制能量转换、参与信号转导、控制物质运输、维持细胞和组织结构等,因此膜蛋白一直是研究热门,是当前近70%的药物靶标。

想要研究更具体膜蛋白结构或者功能特性,我们首先要提取纯化相应的膜蛋白。接下来以一篇经典Nature文章为例,解析如何提取纯化膜蛋白。
2019年Nature文章:人的T cell receptor–CD3 复合体结构研究
纯化思路:
(1)重组蛋白的构建:
以哺乳细胞HEK293F为表达宿主,在C末端依次加了Strep和His标签。
目的基因:TCRα,TCRβ(pCAG)+CD3γ、δ、ε、ζ(pcDNA3,4)。
(2)重组蛋白的诱导表达:
在37℃、含有5%CO2条件下,120 rpm 培养60 h。
(3)细胞膜结构的制备和溶解:
通过离心收集细胞,然后匀浆破碎。
细胞膜结构组份的收集:用25 mM HEPES,pH 7.5,1 M NaCl缓冲溶液重悬,加入1mM PMSF,100,000g超速离心30 min收集细胞膜结构组份。
细胞膜结构的溶解:用25 mM HEPES,pH 7.5,150 mMNaCl,1% DDM,0.2% cholesteryl hemisuccinate tris salt, 1 mM PMSF, 4℃条件下溶解2 h。
40,000g 离心30 min,收集上清,即为可溶的膜蛋白粗溶液。
(4)亲和层析纯化:
本文作者用StrepTactin 填料进行纯化。
结合条件:4℃结合3 h;
Wash buffer: 25 mM HEPES,pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.06% digitonin;
Elution buffer: 25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.06% digitonin+4 mM desthiobiotin
 

图1 亲和层析后,各个亚基的SDS-PAGE图


(5)膜蛋白复合体交联
蛋白质浓缩后用0.1%(v/v)的戊二醛交联40min,得到膜蛋白复合体。
(6)凝胶过滤分子筛层析:
用Superose 6 increase 10/300, buffer为25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.06% digitonin
 


图2 TCR-CD3复合体SDS-PAGE图


膜蛋白复合体TCR-CD3交联后进行凝胶过滤分子筛层析,进行SDS-PAGE实验,发现得到比较纯的复合体。
(7)TCR-CD3结构分析
通过冷冻电镜分析,TCR–CD3复合物的最终原子模型包含全长TCRαβ的亚基,完整的ECD和跨膜螺旋CD3γε,CD3δε和CD3ζζ
 

图3 TCR–CD3复合体结构图


看完大佬的实验框架,是不是顿时对自己的实验也有了一些思路?
总结一下,膜蛋白的一般研究流程:


蓝色背景分别是表达系统与去垢剂的选择,是整个流程中至关重要的步骤。
膜蛋白的表达系统:原核表达(大肠杆菌、红杆菌属)、哺乳细胞(HEK293F)、酵母表达、昆虫细胞表达。不同的表达系统的优缺点见下图。
 


去垢剂的选择:去垢剂别名表面活性剂、乳化剂、肥皂等等,分为离子型、非离子型和两性离子型三类。去垢剂是同时具有亲水性和疏水性基团的双极性分子,能够使磷脂双分子层解体并释放膜蛋白,并且为去膜状态下的膜蛋白提供稳定的疏水环境。去垢剂也需要筛选合适的种类和浓度,各自优缺点见下图。
 
蛋白纯化:使用亲和+凝胶过滤(分子筛)即可完成膜蛋白的纯化流程。膜蛋白纯化由于含有去垢剂的存在,离子交换不作为第一选择。


操作TIPS
一、膜蛋白分离

1、膜蛋白的内源表达通常来说是比较低的,如果要提高产量可以通过重组膜蛋白的过表达,可以选择大肠杆菌,酵母,哺乳动物或者无细胞表达体系。然而,外源表达的翻译后修饰例如糖基化,磷酸化和乙酰化和天然蛋白的不同可能会导致重组蛋白的某些活性下降(原核表达没有翻译后修饰系统),可以考虑通过对组成修饰的氨基酸进行位点突变来改善。
2、跨膜蛋白具有较高的疏水性,经常需要高浓度的去垢剂来帮助溶解。此外,膜蛋白也溶液形成聚集体,甚至是在去垢剂存在的情况下,会影响下游纯化效率。去垢剂的选择也会影响下游纯化步骤的效率。例如,在带有电荷的去垢剂存在的情况下不适合使用离子交换层析;而在有去垢剂的情况下也不适合使用疏水层析。
3、一旦溶解之后,膜蛋白经常会变得更易于被蛋白酶降解。因此添加蛋白酶抑制剂例如EDTA和PMSF是很重要的(如果下游使用普通Ni柱纯化,不能使用EDTA)。


二、外周膜蛋白提取

外周膜蛋白可以使用相对温和的技术来分离,破坏外周膜蛋白和细胞膜之间的静电作用或者氢键,而不破坏整个细胞膜。通常使用的试剂参见表一。使用含有高盐离子浓度的缓冲液进行提取很有用因为他们会降低膜蛋白和带有电荷的脂质之间的静电相互作用。
 
在提取缓冲液提取10-30min后,剩下的膜双层结构和相关的膜内蛋白可以被离心分离(30-60min,100,000xg),释放的外周膜蛋白存在于上清液中。


三、跨膜蛋白的提取

为了溶解得到跨膜蛋白,破坏膜双层结构是必要的。通常使用去垢剂的方法。去垢剂是一种两性分子,同时包含疏水和亲水的部分,并且在水中会形成胶束。胶束是去垢剂亲水头向外,疏水头向内排列的聚集体形式。去垢剂溶解蛋白通过一端结合蛋白的疏水部分,另一端结合亲水部分。去垢剂的选择应该足够溶解膜蛋白而不会造成不可逆的变性。常见的去垢剂见表二。

当筛选去垢剂时,要注意每个去垢剂的临界胶束浓度(CMC)。CMC是指自由的去垢剂分子形成胶束结构需要的浓度。因为溶液相当于膜蛋白从细胞膜上去除进入去垢剂胶束,所以CMC是蛋白提取所需的最低浓度。CMC值可参考表二。
 


四、去垢剂的筛选
为保证膜蛋白的溶解效率,需要对去垢剂类型及浓度进行筛选: 
去垢剂筛选条件建议
 
•一般使用PBS或Tris buffer进行去垢剂筛选
• DDM 常用作初始尝试的去垢剂
• CHAPS 和digitonin被证明在毕赤酵母体系中的细胞膜溶解具有较好的效果
• 可以考虑多种去垢剂混合使用
• 一些脂质、小的两性物质(如1,2,3-庚三醇)或目标蛋白的一些已知配体可以提升膜的溶解效率

五、去垢剂快速筛选
FSEC用于表达条件和去垢剂的快速筛选。FSEC(Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography),又叫荧光检测尺寸排阻色谱法。具体方法是将目的基因构建在带有GFP标签的融合表达载体上,进行小量表达。通过不同的去垢剂溶解后,然后上样微量色谱柱,使用AKTA系统的紫外,荧光检测器进行检测(荧光检测器需搭配)。由于目的蛋白带有GFP标签,使用荧光检测会显示出荧光信号。通过峰型和峰面积我们可以检测到蛋白表达和溶解情况。
 


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参考文献
【1】Dong D, Zheng L, Lin J, et al. Author Correction: Structural basis of assembly of the human T cell receptor-CD3 complex. Nature. 2021;590(7846):E52. doi:10.1038/s41586-021-03245-4
【2】Walls, Dermot; Loughran, Sinéad T. (2017). [Methods in Molecular Biology] Protein Chromatography Volume 1485 || Strategies for the Purification of Membrane Proteins. , 10.1007/978-1-4939-6412-3(Chapter 21), 389–400. 

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