Biacore_检测蛋白与蛋白相互作用

蛋白是生物功能的主要体现者，蛋白的表达水平、活性强弱和相互作用等与生物学功能密切相关，如复制转录、信号转导、新陈代谢、抗体药物等，错误的蛋白相互作用会引起紊乱和疾病。因此，蛋白的相互作用分析成为目前生物大分子研究中必不可少的重要手段。
蛋白-蛋白相互作用分析方法有很多，比如ELISA、CoIP、FRET、Y2H等，但这些方法往往受到需要标记、检测灵敏度低、假阳性高、无法定量等限制。以Biacore为代表的表面等离子体共振（SPR）技术，无需对分子进行标记，能够实时观测微量、灵敏、快速、动态的定量表征结合过程，为正确全面地判定分子间相互作用提供可靠的数据支持！
Biacore在蛋白-蛋白相互作用领域的研究涉及到科学研究的很多方面，比如：
（1）结构生物学
（2）病毒入侵机制
（3）植物调控的分子机理，抗逆机制
（4）转录因子
（5） 食品含量测量
（6）疾病的分子机理研究等
接下来以BiacoreT200仪器为例，解析蛋白与蛋白互作实验操作流程。

Biacore T200 检测蛋白与蛋白结合操作指南

实验前准备
•   S 系列 CM5 芯片，货号：29-1049-88 ( 一片装 )、BR-1005-30 ( 三片装 )、29-1496-03 ( 十片装 )，
( 注：每张芯片若一次性使用，可检测三对不同的互作，若再生后重复使用，只要蛋白一直有活性，就可一直使用 )。
•   氨基偶联试剂盒 ( 货号：BR-1000-50),( 注：里面 的 EDC 和 NHS，溶解后，200ul 每管分装，-20℃冻存， 后续实验前，各取一管融化后使用即可 )。
•   偶联 Buffer：10mM 醋酸钠 pH4.0 ( 货号：BR-1003-49 )，或 10mM 醋酸钠 pH4.5 ( 货号：BR-1003-50 )。

•   缓冲液：10 x HBS-EP+ ( 货号：BR-1006-69 )，用去离子水稀释10 倍，配置500 mL，置于T200 系统左侧托架上，将缓冲液进液管 A 插入瓶中。
•   再生溶液 Glycine 1.5 ( 货号：BR-1003-54 )。( 也可扫描右侧的二维码选择含上述所有耗材的套餐 )

•   无盖 1.5 ml EP 管 ( 货号：BR-1002-87 )。

•   蛋白 A 和蛋白 B：母液浓度＞ 0.2 mg/mL，蛋白总量至少各 20 μg。

实验步骤
芯片的放置与缓冲液置换
•   将运行缓冲液，水瓶，废液瓶分别放置在左右托盘中，并插入相应的进液管。

•   点击 Biacore T200 Control Software 工具条中的 或 ，点击 Eject Chip，打开芯片舱门。选择New Chip，现在 Chip type 为 CM5。

以本实验为例
•   手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。点击 Dock Chip。结束后，选择 Tools → Prime 命令，点击 Start。结束后，点击 Close，系统自动转入待机 (Standby) 状态。

 

蛋白 A 偶联
•   点击控制软件 File 下面的 Open/New wizard template，选择 immobilization，双击。在 Chip type 中选CM5，在 Flow cells per cycle 选 1。勾选 Flow cell 2，method 选用 amine，Ligand 输入配体名称 ( 本实验为A)，选用 aim for immobilized level，Target level 输入配体目标偶联量 ( 参考表一 )。点击 2 次 Next。

表 1. 偶联量与配体工作浓度参考表

分子量比（配体 A/ 分析物 B）	≤1	1~5	5~10	10~50	>50
目标偶联量	500 RU	1000 RU	2000 RU	5000 RU	>10000 RU
配体工作浓度	2 μg/mL	10 μg/mL	20 μg/mL		50 μg/mL

•   将 Reagent Rack 改为 Reagent Rack1，点开左下方 Menu 后选 Automatic Positioning，Vial siza 选项选择Medium，若要合并相同样品，pooling 选项选择 yes，点击 OK。根据下图中样品名称及体积 ( 大于该指定体积即可 ) 进行样品准备。配体蛋白用 pH4.0 的醋酸钠溶液稀释至对应浓度 ( 参考表一 )。点击左下方Eject Rack，取出样品架，将准备好的样品放到对应位置。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。
( 注：所有 EP 管的盖子务必剪去 )。

•   点击Next，点击 start，保存 method 与result 文件。系统将自动在芯片表面包被目标偶联量的配体蛋白， 并自动生成偶联报告。
•   偶联结束后，即可进入下一步实验，无需等待基线平衡。

多循环动力学检测
•   点击控制软件 File 下面的 Open/New wizard template，双击 Kinetics/Affinity。将 Flow path 点为 2-1 ( 如果蛋白偶联在 flow cell 4，则选 4-3 )，Chip type 选择 CM5。点击 Next。

•   Startup 中 Solution 填 HBS-EP+，Number of cycle 改为 5，点击 Next。Sample 中 Contact time 为 180s ( 或 120s )， Dissociation time 为 300s，Regeneration 中 solution 为 Glycine 1.5。点击 Next。

•   Kinetics/Affinity-Sample 界面，填写分析物信息：Sample id 填写样品名称， Concentration 填写分析物系列浓度( 由低到高、五倍稀释)，注意浓度单位选择，推荐浓度如下：偶联结束后，即可进入下一步实验， 无需等待基线平衡。 
 
•   点击 2 次 Next。将 Reagent Rack 改为 Sample and Reagent Rack1( 或根据样品数量选择其他 rack 或 96/384 孔板)，再点开左下方 Menu 后选Automatic Positioning，Vial siza 选项选择 Medium，若要合并相同样品， pooling 选项选择 yes，点击 OK。根据下图样品名称及体积 ( 大于该指定体积即可 ) 进行样品准备。蛋白B 母液先用左托盘中的运行缓冲液 1x HBS-EP+ 稀释至 100μM，再用 1x HBS-EP+ 进行 5 倍稀释。点击左下方 Eject Rack，取出样品架。根据图示样品位置进行放置，盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。( 注： 所有 EP 管的盖子务必剪去 )。点击 Next，对方法进行保存，再对数据路径 ( 可使用系统 默认的，也可自行指定，注意所保存的文件名及指定文件夹名均不能有中文字符 ) 进行保存，仪器便会开始自动运行。
         

结果分析
•  打开 Biacore T200 Evaluation Software，点击 ，找到保存的结果文件。点击左侧 Plot 中的 Binding to reference，检查各个点是否趋于一致或小于 binding level 中对应响应值的 20%，再检查 binding level 各个点的响应值是否存在明显的浓度依赖。如是，直接跳到下一步。注：若 Binding to reference 各个点的响应值也存在浓度依赖且大于 binding level 中对应响应值的 20%，即存在非特异性结合。此时可尝试提高运行缓冲液中盐离子浓度或提高 P20 ( 货号：BR-1000-54 ) 浓度不超过 1%，或者调换配体与分析物，将B 偶联在芯片上，将 A 作为分析物。若 baseline 中各个点的响应值上飘，可适当延长 glycine 1.5 溶液的进样时间。
•  点击上方中间位置的 Kinetics/Affinity，在下拉栏里点击 Surface bound，在跳出的窗口中选择不同的浓度进行拟合。选择标准为：如果最高浓度响应值大于 500 RU，选最低的 5 个浓度分析，如果最高浓度响应值小于 50 RU，选最高的 5 个浓度进行数据分析，介于两者中间，随意选 5 个连续的浓度进行分析。不需要的浓度，可在样品浓度表格中将此浓度前的对号去掉即可。
 

•  点击右下角 Next，再点击右下角 Kinetics ( 当传感图为 “ 快上快下 ” 时，选 Affinity )，点击左上角 Fit 进行数据拟合，点击右下角 Finish 完成。
•  在下方数据显示栏里，Quality Control 的前三项都亮绿灯表示检测数据好；如果亮黄灯，表示数据能接受；如果亮红灯，表示数据不能接受，需要优化实验。数据显示栏的 Report 中显示具体的分析数据，包括动力学数据ka、kd，亲和力数据 KD 等。以本实验为例，动力学数据：Ka = 3672 M-1s-1，Kd = 0.001807 s-1， 亲和力：KD = 4.921 × 10-7 M。
•  将鼠标放在图上，点击右键可以直接 copy graph ( small，medium，large ) 用于文章发表，也可以右键点击 export curve，导出 txt 文本后自行用第三方软件作图。

  

相关试剂：

货号	产品名称	规格
29104988	Series S Sensor Chip CM5-1-pack	1片
BR100530	Series S Sensor Chip CM5	3片
29149603	Series S Sensor Chip CM5, 10-pack	10片
BR100050	Amine Coupling Kit	/
BR100349	Acetate 4.0	50ml
BR100350	Acetate 4.5	50ml
BR100352	Acetate 5.5	50ml
BR100351	Acetate 5.0	50ml
BR100357	Glycine 3.0	100ml
BR100356	Glycine 2.5	100ml
BR100355	Glycine 2.0	100ml
BR100354	Glycine 1.5	100ml
BR100188	HBS-EP	6x200ml
BR100368	HBS-P	6x200ml
BR100369	HBS-N	6x200ml
BR100669	HBS-EP 10x	1x1000ml
BR100826	HBS-EP 10x	4x50ml
BR100671	HBS-P 10x	1x1000ml
BR100827	HBS-P 10x	4x50ml
BR100670	HBS-N 10x	1x1000ml
BR100828	HBS-N 10x	4x50ml
BR100287	Plastic Vials 1 5 ml	/
BR100411	Rubber Cap type 2	/
BR100503	Microplate  96 well	/
28975816	Microplate Foils (96 well)	/