二抗选择超全攻略，一秒收藏！

你是否在选择二抗的时候遇到过以下的情况：
IHC/IF多标实验中一抗二抗种属傻傻分不清？荧光标记不知道怎么选择？
IHC实验结果不准确，遇到高背景、假阳性的情况？
一抗种属来源相同时，不知该选择什么样的二抗来进行同步法IF双标记染色？
IP/Co-IP后的WB实验出现非特异性条带？
别急，这篇超全的二抗选择攻略可以助你解决这些疑惑。

本文将从两个角度（1）二抗选择的基本步骤（2）不同的实验怎么选择二抗，来教大家如何在日常实验中选择二抗，干货满满，也可以先收藏后看哦~

Part one.选择二抗的4个基本步骤
1. 选择正确的种属来源和反应物种
二抗的选择首要基于一抗，应与一抗的种属来源相对应，且需要来自于不同的物种（如下图所示）。
 

图1.二抗种属反应物种应与一抗种属来源相同，且来源应与一抗种属来源不同。

2. 选择正确的二抗形式
选择合适且正确的二抗形式，也是获得实验成功的关键之一。三种二抗形式Whole IgG、F(ab')₂ 、Fab如下图所示。
 

图2. “Y”型的二抗分子可以被酶水解成两种不同的形式

3. 抗体特异性的选择
要注意区分二抗的特异性和形式的不同，特异性指的是二抗识别的不同一抗亚型或某特殊区域。抗体的特异性主要基于以下三种形式：
（1）轻链特异性
（2）Fc端特异性
（3）亚型特异性
 

图3.免疫球蛋白的不同类型和亚型，以及不同亚型特异性二抗分子识别不同亚型样本示意图。

4.偶联标记的选择
不同实验类型适合的标记类型不一样，如下表所示：

实验类型	适合的标记类型
WB/ELISA	酶标（HRP/AP）/ 生物素标记 / 荧光标记
IHC	酶标（HRP/AP）/ 生物素标记
IF/ICC	生物素标记 / 荧光标记
Flow cytometry	生物素标记 / 荧光标记

对于多标染色实验，下面有几种常用的配色参考（除细胞核染料外）：

	双色	三色	四色
标记1	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
标记2	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 555
标记3		Alexa Fluor 647	Alexa Fluor 594
标记4			Alexa Fluor 647

Part Two.基于不同实验类型的二抗使用指南
1.常规WB实验→选择Whole IgG全片段二抗
对于常规的WB实验，在基于正确的种属来源和反应物种原则上，我们一般选择酶标或生物素标记的没有特殊形式的全片段二抗。

常规WB部分相关二抗推荐：

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	偶联标记	规格
111-035-003	山羊/兔	Whole IgG	HRP	2 ml
115-035-003	山羊/小鼠	Whole IgG	HRP	2 ml

2. 荧光WB实验→选择带有荧光基团的Whole IgG二抗
与化学发光WB实验所使用的酶标记二抗不同的是，荧光WB需选择带有荧光基团的二抗（如FITC/Dylight/Alexa Fluor荧光二抗）。此外还需要搭配有合适光源和滤光片的成像仪器，如奥德赛、Bio-rad等。
 

图4.使用带有Alexa fluor^®680和Alexa fluor^®790基团的二抗进行荧光WB实验的示意图

荧光WB部分相关二抗推荐：

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	特异性	偶联标记	可去除的交叉反应	规格
115-625-146	山羊/小鼠	Whole IgG	/	Alexa Fluor® 680	Hu, Bov, Hrs, Rb, Sw Sr Prot	0.5mg
115-655-146	山羊/小鼠	Whole IgG	/	Alexa Fluor® 790	Hu, Bov, Hrs, Rb, Sw Sr Prot	0.5mg

3.IP后WB实验→根据目标蛋白分子量，选择轻链特异性二抗或Fc片段特异性二抗
在IP或 co-IP实验中，IP实验及之后的WB实验的操作过程中通常会用到相同的一抗或同种属来源的一抗、这种情况下，如果使用常规无特异性的Whole IgG酶标二抗，WB实验中IP抗体变性后产生的重链（55kDa）和轻链（25kDa）都能够识别， 而此非特异的信号往往会部分甚至完全掩盖目的蛋白的信号。

因此，当目标蛋白位于55kDa分子量附近时，需要选择抗轻链（anti-light chain）的二抗，以避免重链的干扰（如图11）；反之，当目标蛋白位于25kDa分子量附近时，需要选择抗Fc端的二抗，以避免轻链的干扰

此外，如果有同时去除轻链或重链干扰的实验需求时，还可以选择构象特异性（conformation specific）的二抗。
 

图11. （A）使用构象特异性二抗的WB结果，（B）使用抗轻链二抗的WB结果，（C）使用普通酶标Whole IgG无特异性二抗

IP后WB部分相关二抗推荐：

货号	种属来源/对应一抗种属	特异性	偶联标记	可去除的交叉反应	规格
115-035-174	山羊/小鼠	轻链	HRP	Bov, Gt, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Ig	0.5 ml
109-035-098	山羊/人	Fc	HRP	Bov,Hrs,Ms Sr Prot	1 ml
5127S	小鼠/兔	可同时避免轻链及重链干扰	HRP		100 μl
3678S	小鼠/兔	可同时避免轻链及重链干扰			100 μl

4. IHC/ICC/IF实验→选择F(ab')₂ 形式的片段二抗
在研究某些细胞和组织时（如白细胞群体：巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞等；某些组织：淋巴结，脾脏，外周血等），这些细胞或组织因表面Fc端受体过多，会与抗体分子中的Fc端相结合，从而导致非特异性结合和高背景的现象（如下图所示），俗称“假阳性”。

使用F(ab')₂ 形式的二抗可以避免其与活细胞中的Fc受体非特异性结合，还可避免与Protein A、ProteinG的非特异性结合，从而提高实验准确性。

 

图5.使用F(ab')₂ 片段二抗可以避免“假阳性”情况

IHC/ICC/IF部分相关二抗推荐

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	特异性	偶联标记	可去除的交叉反应	规格
109-066-006	山羊/人	F(ab')₂	F(ab')₂	Biotin		0.5 ml
109-006-098	山羊/人	F(ab')₂	Fc		Bov,Hrs,Ms Sr Prot	1 mg
109-136-098	山羊/人	F(ab')₂	Fc	APC	Bov,Hrs,Ms Sr Prot	0.5 ml

5. 多标记染色IF/IHC实验→选择经预吸附处理的二抗 
（1）为了防止二抗与样本，以及其他一抗种属的交叉反应，进行多标记实验的时候，首先需要选择经预吸附处理的二抗，以减少这种交叉反应；
（2）所有二抗都应尽可能的来自同一宿主物种，以此来限制二抗与来自其他物种的一抗之间的交叉反应。下图给出了一种三标实验搭配参考，因样本和三支一抗的来源分别为小鼠、山羊、兔及大鼠，应选择能够去除这几种种属交叉反应的二抗。
 

图6.进行三标染色实验时，实验样本为小鼠的二抗选择参考

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（3）如果一抗种属来源于不同的亚型，那么二抗则不需要来源于不同的物种，只需要选择对应的亚型特异性二抗即可，如图7所示。
 

图7.一抗种属来源于不同亚型的三标实验

多标染色IF/IHC部分相关二抗推荐

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	特异性	偶联标记	可去除的交叉反应	规格
711-545-152	驴/兔	Whole IgG		Alexa Fluor® 488	Bov,Ck,Gt,GP,Sy Hms,Hrs,Hu,Ms,Rat,Shp Sr Prot	0.5 mg
712-585-153	驴/大鼠	Whole IgG		Alexa Fluor® 594	Bov,Ck,Gt,GP,Sy Hms,Hrs,Hu,Ms,Rb,Shp Sr Prot	0.5 mg
705-605-147	驴/山羊	Whole IgG			min X Ck,GP,Sy Hms,Hrs,Hu,Ms,Rb,Rat Sr Prot	0.5 mg
NBP2-69595	山羊/小鼠	Whole IgG	IgG2b			10 mg
NBP2-69628	山羊/小鼠	Whole IgG	IgG3			10 mg

6. 一抗来源相同的双染IF实验→选择Fab形式的片段二抗
有时因受限于实际的实验条件，在进行双染色的IF实验时，一抗来源于同物种。这时可以选用Fab片段二抗来进行实验，这是因为每个Fab片段二抗只含有一个抗原结合位点，因此在随后的孵育过程中不会与另一个分子相结合(即在进行顺序双标记时的第二个一抗)。
以下有两种使用Fab片段二抗进行双标记染色的方法可供大家参考：
（1）来自同一种属的两种一抗均未标记时
     

Step1. 用血清进行阻断后，与第一种一抗孵育，本示例中为Rabbit Anti-Antigen X    

Step2.与过量的偶联二抗孵育，本例为Alexa Fluor^®488标记的Goat Anti-Rabbit Fab片段二抗

Step3. 与第二个一抗进行孵育， Rabbit Anti-Antigen Y

Step4. 与第二种偶联二抗孵育，本例中为Rhodamine Red ™标记的Goat Anti-Rabbit Whole IgG二抗

图8.使用Fab片段二抗进行一抗来源相同的双染IF实验（参考一）

（2）来自同一种属的一种未标记一抗和一种或多种标记的一抗

     

Step1. 用血清进行阻断后，用偶联的一抗进行孵育，本示例中为Alexa Fluor^®488标记的Rabbit Anti-Antigen X    

Step2. 与过量的未偶联的Goat Anti-Rabbit Fab片段二抗进行孵育

     

Step3. 用未偶联的一抗进行孵育，本示例中为Rabbit Anti-Antigen Y 一抗

Step4. 与偶联的二抗进行孵育，本示例中为Rhodamine Red ™标记的Goat Anti-Rabbit Whole IgG二抗  

图9.使用Fab片段二抗进行一抗来源相同的双染IF实验（参考二）

不建议使用F(ab')₂片段抗体进行双重标记实验，因为其为二价分子，含有两个结合位点。在与第一个一抗结合之后，第二个结合位点可能仍未被占据，而这个未被占据的结合位点能够与第二抗体结合，导致假阳现象。

Tips：Fab片段二抗还可用于封闭内源性免疫蛋白：
当一抗与所研究组织种属来源相同时(例如，小鼠一抗用于小鼠组织)，可以使用Fab片段二抗来阻断内源性免疫蛋白，以提高实验的准确性。
 

图10.（a）未封闭的内源性免疫蛋白会与随后加入的二抗分子结合，干扰实验（b）经过Fab封闭后， 内源性免疫蛋白不会与随后加入的二抗分子结合

一抗来源相同的双染IF部分相关二抗推荐

货号	种属来源/对应一抗种属	二抗形式	特异性	偶联标记	规格
115-007-003	山羊/小鼠	Fab			1.0 mg
109-117-008	山羊/人	Fab	Fc	R-PE	0.5ml
109-607-008	山羊/人	Fab	Fc	Alexa Fluor® 647	0.5mg
115-007-020	山羊/小鼠	Fab	µ chain		1.0 mg

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