体外诊断业的宠儿——游离DNA

随着2015年精准医疗计划的提出，液体活检技术备受关注。液体活检常见的三种有效素材主要有：游离DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、外泌体。

图1 液体活检方案。人体血液中含有细胞、胞外膜囊泡(EMVS)、游离DNA (cfDNA)、游离RNA (cfRNA)和蛋白质，可作为各种疾病的生物标志物

 

一、什么是游离DNA?

游离DNA又称循环DNA、无细胞DNA，是指存在于血浆、血清或尿液等体液中的细胞外DNA。循环肿瘤DNA是指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段，是肿瘤患者cfDNA的一种。最早在1948年，Mandel次在人类血液中检测到存在cfDNA,但当时并没有引起科学界的关注。直到1977年,Leon等报道了肿瘤患者外周血中存在较高水平的cfDNA，随后众多学者开始了肿瘤患者外周血中cfDNA研究。1997年,香港的卢煜明教授运用PCR技术在孕妇的血浆中扩增了Y染色体特异性片段,证明怀有男胎的孕妇血浆中存在胎儿cfDNA,从而为无创产前筛查奠定了基础。

关于cfDNA的产生来源，目前普遍认为细胞主动释放、细胞发生凋亡、细胞坏死释放的DNA片段是cfDNA的主要来源。一般来说，癌症患者的正常循环cfDNA水平比健康人高得多。因为随着肿瘤体积的增大，细胞的更新也随之增加，凋亡和坏死细胞的数量也随之增加。在正常的生理情况下，凋亡和坏死的残留物可通过浸润的吞噬细胞清除。但这不能有效地发生在肿瘤肿块内，导致细胞碎片的积累不可避免地释放到循环中使cfDNA浓度显著升高。

图2 游离DNA的主要来源

cfDNA大部分为双链DNA分子，其片段分布与核小体的结构有关，每个核小体单位包括一个组蛋白八聚体、DNA分子及一分子H1；组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构，146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈，组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起到稳定核小体的作用。因此cfDNA长度主要集中在80-300bp,峰值位于166bp左右，且存在10.4bp的波动。cfDNA在健康个体中通常浓度很低，血浆cfDNA被认为主要来自造血系正常细胞的凋亡，其他组织的贡献很小。并且cfDNA的半衰期很短，仅1-2小时，不稳定易降解。

相比于组织而言，检测cfDNA具有三大优势1.可及性：cfDNA容易获取，且可以反复取样；2.全面性：可全面反映肿瘤组织的异质性；3.实时性：可实时动态监测疾病的状态（如耐药方面），因此cfDNA检测逐渐成为体外诊断应用方面的宠儿。

 

图3 cfDNA的结构

图4 常规测序文库制备测定cfDNA的片段长度

二、游离DNA应用实例

图5 cfDNA的应用

 

1.无创产前筛查（NIPT）

基于1997年卢煜明教授及其团队发现孕妇的血浆内存有高浓度的胎儿DNA，他们研发推出了唐氏综合征的无创检验方法—NIPT（noninvasive prenatal testing），迅速被超过90个国家所采用。NIPT即无创性胎儿染色体非整倍体检测，也称无创产前DNA检测,在临床上主要用于唐氏综合征的筛查。通过采集孕妈妈外周血，从中提取游离DNA（包含妈妈和宝宝DNA），来分析宝宝的染色体情况。但以目前的医疗水平还不能治愈唐氏综合征，所以加强孕期产检，减少唐氏综合征患儿的出生十分重要。

图6 NIPT检验流程

2.肿瘤相关分析

无需有创肿瘤活检，而是直接从常规抽血中分析来自肿瘤的DNA，cfDNA分析在癌症发展、诊断和治疗的整个自然过程中具有多种潜在应用。Web of science引文报告显示：2017年与2018年间与cfDNA研究有关的文章，51%聚焦于肿瘤方面，由此可见cfDNA在肿瘤方向的应用火热。2016年6月1日，FDA批准首个适用于血液cfDNA检测的、用于检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的基因检测试剂盒，这是作为cfDNA首次应用于肿瘤伴随诊断、药物疗效监测的批准。同时Nitzan等于nature reviews cancer杂志上发表名为“Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA”的文章表明ctDNA可用于耐药突变及新发突变分析。

图7 ctDNA可用于耐药突变及新发突变分析应用

2020年发表于Nature杂志上的一篇文章，研究者对早期的肺癌患者治疗前血浆中ctDNA的含量进行检测研究，发现在一定时间内（监测100个月）肺癌患者治疗前ctDNA高的病人复发率以及远处转移率均高于ctDNA含量低的病人，因此ctDNA对于肿瘤的监测及预后方面具有一定积极意义。

图8 cfDNA在肿瘤动态监测、预后方面的应用

Jay Shendure等于Cell杂志上发表的文章利用癌症患者的ctDNA样本进行测序，发现不同的癌症类型可以ctDNA上产生不同的核小体的指纹。因此对于某些癌症患者而言，研究者可以利用ctDNA鉴别肿瘤的组织学来源。

图9 ctDNA可以用于分析肿瘤组织来源（在癌症溯源方面应用）

由复旦大学金力院士牵头的癌症早筛研究结果于2020年发表于Nature Communication杂志，该研究采用PanSeer癌症早筛技术，通过检测cfDNA甲基化状态实现多癌种筛查，可提前4年发现癌症患者血液中的甲基化信号，实现癌症早筛的功能。

图10 cfDNA在癌症早筛中的应用

3.微生物感染诊断

与传统微生物检测相比，微生物游离DNA(mcfDNA)检测阳性率更高，mcfDNA目前已在临床感染的诊治中发挥了重要作用，如脓毒症、社区获得性肺炎、结核病、侵袭性真菌病、尿路感染、器官移植后感染等。Blauwkamp等于Nature Microbiology上发表的血浆mcfDNA高通量测序研究中表明：临床纳入348例疑似脓毒症患者，与首次阳性的血培养相比，其阳性符合率为93.7%。在出现症状前出现抗菌药物的患者中，NGS检出可靠或者确定的病原比例为47.9%，血培养灵敏度为19.6%，由此可见mcf检测微生物感染的优势。

图11 微生物游离DNA在感染诊断中的应用

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参考文献

【1】Szilágyi M, Pös O, Márton É, et al. Circulating Cell-Free Nucleic Acids: Main Characteristics and Clinical Application. Int J Mol Sci. 2020;21(18):6827. Published 2020 Sep 17. doi:10.3390/ijms21186827

【2】Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997;350(9076):485-487. doi:10.1016/S0140-6736(97)02174-0

【3】Snyder MW, Kircher M, Hill AJ, Daza RM, Shendure J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 2016;164(1-2):57-68. doi:10.1016/j.cell.2015.11.050

【4】Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nat Rev Cancer. 2017;17(4):223-238. doi:10.1038/nrc.2017.7

【5】Chabon JJ, Hamilton EG, Kurtz DM, et al. Integrating genomic features for non-invasive early lung cancer detection. Nature. 2020;580(7802):245-251. doi:10.1038/s41586-020-2140-0

【6】Chen X, Gole J, Gore A, et al. Non-invasive early detection of cancer four years before conventional diagnosis using a blood test. Nat Commun. 2020;11(1):3475. Published 2020 Jul 21. doi:10.1038/s41467-020-17316-z

【7】Blauwkamp TA, Thair S, Rosen MJ, et al. Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nat Microbiol. 2019;4(4):663-674. doi:10.1038/s41564-018-0349-6