活体转染第八弹之瘤内注射

体内核酸递送的方法分为病毒载体介导和非病毒载体介导。但两种方法各有优劣势，病毒载体具有靶向性，递送效率高。但是由于其生物安全性问题，容易引起免疫反应，质粒片段大小受限，并且成本高的缺点。非病毒载体的需求逐渐增加。非病毒载体比如体内转染试剂in vivo jetPEI,无安全性问题,无基因片段大小限制,同时使用便捷性价比更高，越来越受到用户青睐。

上一期给大家介绍了使用in vivo jet PEI进行玻璃体腔的注射应用案例，本期小编给大家分享两篇瘤内注射的案例。

案例一：

这是一篇发表在Cancer Medicine上的题为“PAI-1,a target gene of miR-143, regulates invasion and metastasis by upregulating MMP-13 expression of human osteosarcoma”的文章

实验方法：

1、选取5至6周龄的雄性无胸腺裸鼠，在第0天和随后的几天通过暴露于3%异氟醚进行麻醉。

2、在第 0 天，为了获得实验模型，将麻醉动物向右后肢膝关节注射 3.0 × 10⁶ 143B-Luc 细胞。

3、根据制造商的方案，配置单只老鼠siRNA和in vivo jetPEI（Polyplus-transfection，New York，NY）的转染复合物体系：12ug siRNA，N/P=10（核酸/转染试剂）。

4、在接种 143B-luc 细胞后第 1 天进行注射，每 3 天一次进行瘤内注射，每次注射100 μL。

实验结果：

1、作者为了检查 PAI-1 在体内骨肉瘤细胞肺转移中的作用。将143B-luc 细胞接种到右膝关节中，并立即使用体内成像系统检查其位置。细胞接种后，每组瘤内给药PAI-1 siRNA 或对照 siRNA，与in vivo-jetPEI 的转染复合物，每 3 天一次。1周后，仅在原发病灶检测到萤火虫荧光素酶信号，两组均未在肺部区域检测到信号。

2、接种后 5 周，给予对照 siRNA 的 11 只小鼠中有 11 只（100%）显示出来自肺部区域的荧光素酶信号，提示肺转移;然而，在给予PAI-1 siRNA的10只小鼠中，只有5只（50%）显示出类似的荧光素酶信号，而其他5只小鼠在肺部区域没有显示出信号。在肺部区域具有荧光素酶信号的对照组和siRNA给药小鼠的数量差异显着（图3A和B，P < 0.05）。

3、尸检后通过组织学分析证实了荧光素酶信号指示的骨肉瘤细胞的肺转移。通过Ki-67免疫组织化学染色确定了PAI-1 siRNA组和对照siRNA组的原代肿瘤细胞之间的细胞增殖没有差异（图3C）。此外，原发肿瘤的大小和体积没有差异（图S1A和B）。作者证实 PAI-1 siRNA 降低了原发肿瘤中 PAI-1 的表达（图 S1C）。

体外和体内数据表明，PAI-1通过促进肿瘤侵袭活性来促进骨肉瘤细胞的肺转移，但不促进肿瘤细胞增殖。

图3. PAI-1 siRNA 调节 143B 细胞的肺转移。（A）将 143B-luc 细胞接种到模型小鼠的右膝关节中。如IVIS 成像仪（上图）所见，显示了接种后 1 周和 5 周的代表性生物发光，以及接种后 5 周时代表性的肺 H&E 染色（下图）。比例尺，100 μm。（A）表显示了5周时发生肺转移（meta +）的小鼠数量超过两组小鼠总数。（B）在 siRNA 接种后 5 周在获得的小鼠转染对照 siRNA 或 PAI-1 siRNA 肺转移的 IVIS 图像中测量的总通量（光子每秒，p/秒）。（C）对照组和 PAI-1 siRNA 转染小鼠原代肿瘤细胞中 Ki-67 的代表性组织化学染色。通过在高倍率下计数 10 个视野来计算 Ki-67 阳性的肿瘤细胞百分比。比例尺，50 μm。PAI-1，纤溶酶原激活物抑制剂-1;IVIS，活体成像系统。

案例2：

第二篇题为《Improved nonviral cancer suicide gene therapy using survivin promoter-driven mutant Bax》发表在Cancer Gene Therapy

实验方法：

1、6周龄雌性Balb/c小鼠侧腹注射10⁶ DA-3鼠乳腺癌细胞。当肿瘤直径达到5-6毫米时，将小鼠分成不同的组，并用不同的载体治疗。

2、将50 μg无内毒素DNA与in vivo-jetPEI（polyplus transfection）混合形成转染复合物，每隔一天进行一次瘤内注射，共注射3次。每只小鼠 20 μg 的速度在瘤内注射与 jetPEI 复合的各种质粒

3、每组的1只小鼠在第二次注射后48 h处死，收集肿瘤将其固定在中性缓冲福尔马林中用来进行免疫组化。每周两次对小鼠中肿瘤体积进行测量，并根据公式计算

肿瘤体积=ab²×π/6，其中“a”是最长直径，“b”是最短直径。

实验结果：

1、作者为了确认使用皮下小鼠肿瘤模型生成的载体在体内是否有效。选择雌性Balb/c小鼠进行皮下成瘤。当肿瘤直径达到5-6毫米时，向小鼠注射质粒与in vivo-jetPEI转染复合物。小鼠每隔一天总共接受三次注射。每周测量两次肿瘤体积。第二次注射后48小时，每组杀死一只小鼠并收集肿瘤。

2、通过TdT介导的dUTP缺口末端标记染色确定了用Sur-BaxS184del和CMV-Bax处理的小鼠显示出广泛的细胞凋亡（数据未显示）。与这些结果一致，我们观察到Sur-BaxS184del和CMV-Bax的肿瘤生长迟缓（P<0.05），尽管Sur-BaxWT表现出与载体对照相似的肿瘤生长（图9）。

这些研究表明，Sur-BaxS184del显示出与CMV-bax相似的活性，并提供了一种良好的肿瘤靶向基因治疗试剂。

图9. 第 0 天在Balb/c 小鼠侧腹皮下注射 10⁶DA-3 小鼠乳腺癌细胞。当肿瘤直径达到 5-6 mm 时，在第 5、7 和 9 天在瘤内注射各种质粒与 in vivo-jetPEI 的复合物，每只小鼠注射含20 μg DNA的转染复合物。每周测量两次肿瘤体积，持续 4 周。数据表示平均± s.e.m.（n = 每组4-5只小鼠）;*，其中与载体（PUC18）治疗的肿瘤存在显著差异（P<0.05）。箭头表示向肿瘤注射DNA PEI复合物的天数。

订阅信息：

货号	产品名称	规格	说明
101000040	in vivo-jetPEI	0.1mL	活体DNA&si/miRNA转染试剂
101000030	in vivo-jetPEI	0.5mL	活体DNA&si/miRNA转染试剂

参考文献：

[1] Hirahata, Mio , et al. "PAI‐1, a target gene of miR‐143, regulates invasion and metastasis by upregulating MMP‐13 expression of human osteosarcoma." Cancer Medicine (2016):892-902.

[2] Garg, H. , et al. "Improved nonviral cancer suicide gene therapy using survivin promoter-driven mutant Bax." Cancer Gene Therapy 17.3(2010):155-163.