调节性T细胞专辑（二）

调节性T细胞专辑（二）
(Regulatory T Cells)

BD的259D/C7克隆— Foxp3蛋白鉴定最佳抗体

抗体特异性的好坏，即抗体能否特异性地结合特定的抗原，是选择正确抗体的关键。由于抗体识别抗原的相对较小区域，不同的抗体结构和结合位点都会影响抗原抗体结合的亲和力。在不同Foxp3抗体中157B/F4和86D/D6克隆主要识别人类Foxp3中第一外显子（aa1-70），150D/E4克隆主要识别第二外显子（ aa70-105），而206D/B1、236A/E7和259D/C7克隆识别N末端（aa105-235）表位（图1B）。由于人Foxp3存在两种异构体：一种对应于经典的全长序列（Foxp3），另一种缺少第二外显子（Foxp3δ2），因而150D/E4克隆是无法检测exon2缺失亚型的。

Bridget C. Fox等对上述几种不同克隆的抗体对Foxp3的结合力进行了比较试验，结果发现，无论是免疫组化还是流式结果BD 的259D/C7克隆都表现出对Foxp3很强的反应（图1A）。而150D/E4和206/B1克隆在流式和免疫组化实验中都表现出对Foxp3的低亲合力。在Western Blot实验中，259D/C7和206D/B1都能够很好的标记Foxp3亚型，236A/E7的标记作用稍差些，而150D/A3克隆就无法检测到exon2缺失的亚型（图1C）。由此Fox BC等得出结论BD 的2 5 9 D / C 7 克隆是Foxp3蛋白表达最敏感的检测抗体（研究发表在2008年Blood上，Defense of the clone: antibody 259D effectively labels human FOXP3 in a variety of applications）

图一、几种Foxp3单克隆抗体结构和抗体结合位点示意图图2、不同克隆抗体对Foxp3结合力总结

优宁维公司为您提供多种Treg相关抗体

货号	名称	克隆	货号	名称	克隆
560046	Human FOXP3 PE	259D/C7	560408	Mouse FOXP3 PE	MF23
560098	Human FOXP3 Buffer Set		560409	Mouse FOXP3 Buffer Set
555346	Human CD4 FITC	RPA-T4	553046	Mouse CD4 FITC	RM4-5
555434	Human CD25 APC	M-A251	557192	Mouse CD25 APC	PC61
560133	Human FoxP3 Staining Kit(FoxP3-PE,CD4-FITC,CD25-APC)		553057	Mouse CD3e NALE	145-2C11
557938	Human CD127 PE	HIL-7R-M21	553294	Mouse CD28 NALE	37.51
555748	Mouse IgG1 κ FITC, Isotype Control	MOPC-21	554688	Rat IgG2a κ FITC, Isotype Control	R35-95
555749	Mouse IgG1 κ PE, Isotype Control	MOPC-21	56925	Rat IgG2b κ PE, Isotype Control	A95-1
555751	Mouse IgG1 κ APC, Isotype Control	MOPC-21	550884	550884 Rat IgG1 λ APC, Isotype Control	A110-1
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CD127 —TREG 突破性体外分离方法，只需要表面染色即可鉴定和分离出TREG

CD127是白细胞介素(IL)-7 受体a链，其表达对T淋巴细胞的成熟、维持及免疫应答发挥着重要作用。过去主要以CD4+CD25high和Foxp3作为人CD4+ CD25+Treg的特异性标记物。但Foxp3为细胞核染色，标记后细胞被破坏，不能用于进一步培养和研究，而且并不是所有Foxp3阳性的细胞都是Treg，Morgan等就曾发现人类Foxp3 mRNA不仅在CD25+T细胞上表达，在CD25 T细胞活化后也可短暂表达。Liu等发现CD127与Foxp3表达呈负相关，Seddiki等发现CD4+ T细胞活化后高表达CD127，即CD4+CD25+CD127high，而真正有活化效应的调节性T细胞仅低表达CD127。研究表明CD127是自然产生的Treg最高的细胞膜标志物。与传统的方法相比，应用CD127/CD25/CD4三标法在人Treg研究中具有以下优势：

● 特异性好，CD127低表达与FoxP3表达极其一致，鉴定时易于判断，避免人为影响。

● 表面标记，无需胞内染色，Treg经分选后可继续培养或可能回输体内，进行相关功能研究。
● 操作简单，避免胞内FoxP3染色反复摸索条件。

● 细胞得率高，与传统的CD4+ CD25high相比其Treg得率可提高2-4倍，并可有效去除CD25 int的T效应细胞

● 应用于自身免疫性疾病和炎症、疫苗、移植-排斥预防、肿瘤生成机制、多发性硬化研究。

CD127在临床上的应用：CD127作为I型糖尿病病人(T1D)调节T定量分析的标志

调节性T细胞群里面的效应T细胞污染给Treg的定量分析和Treg的功能评价带来了干扰，以前一篇文献表明T1D病人的CD4+CD25hi调节T在细胞数目和功能上跟正常人没有区别，而另外一篇文献却显示相反的结果。Liu et al.分别做了T1D病人和没有自主性免疫疾病的正常对照样本中Treg的CD4+CD25+CD127low/- FOXP3+表型定量和功能分析。他们发现就T1D病人中整个大的群体的Treg细胞数目和功能没有下降，与之相反的是，少数几个病人的Treg的数目比其他病人和正常组相对的高，所以作者发现Treg实际上在这个疾病的某些病程阶段增加，从而调节性效应T细胞活性。CD127结合CD4+ CD25+表型分析也可能让其他疾病研究中有冲突的调节T结果得到统一。

BD IMag细胞磁珠分离——分离纯化大量Treg细胞

获得大量的Treg细胞是对其进行研究的前提，正常情况下淋巴结、脾脏及外周血中都存在一定数量的Treg，可以通过CD标记，免疫磁珠或流式分选法获得Treg细胞。

BD公司的Human Regulatory T Lymphocyte Separation Set是为Treg研究量身定做的一款磁珠分离产品。该分离体系分为两部分：首先利用BD IMag链酶亲和素包被的磁珠与生物素标记的识别红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞、B细胞、CD8+ T细胞表面抗原和单克隆抗体结合，通过阴性选择得到CD4+ T淋巴细胞，再利用包被APC抗体的磁珠与APC标记的CD25的抗体结合，通过阳性选择获得CD4、CD25双阳性的Treg细胞，该细胞仍可扩增并保持其功能性表达能力。

首先通过BD Human CD4 T LymphocyteEnrichment Set（Cat.No.557939）分选CD4+细胞(纯度可达90%以上)，随后以FITC标记CD25、PE标记CD127和PerCP 标记CD4进行细胞染色，最后在BD FACSAria分选型流式细胞仪上进行分选和分析。如图所示，分选后的CD4细胞被为分CD127高表达、CD25中等-偏弱表达(CD127hiCD25int-low)和CD127弱表达、CD25高-中等表达(CD127lowCD25hi-int)两个细胞群体。所有的调节性T细胞均存在CD127lowCD25hi-int群体。

BD调节性T细胞分离纯化相关产品

名称	标记	规格	货号
Human Regulatory T Cell Sorting Kit（CD4,CD25,CD127 and CD45RA）	PerCP-Cy5.5,PE,Alexa Fluor-647,FITC	10 tests	560753
Human Regulatory T Cell Cocktail（contains CD127 ,CD4and CD25）	Alexa Fluor-647,FITC,PE-Cy7	50 tests	560249
Human CD127 (IL-7 Receptor a subunit)	PE	0.1mg	557938
	Alexa Fluor-647	100tests	558598
	Biotin	100tests	558633
Mouse CD127 (IL-7 Receptor a subunit)	PE	0.2mg	552543
Mouse CD127 (IL-7 Receptor a subunit)	NA/LE	0.5mg	550426
Regulatory T Lymphocyte Separation Set -DM	Biotin，APC	1*10⁹cells	558142
Human CD4 T Lymphocyte Enrichment Set -DM	Biotin	1*10⁹cells	557939
Human CD25 Magnetic Particles -DM	Biotin	1*10⁹cells	558005
Mouse CD4 T Lymphocyte Enrichment Set -DM	Biotin	1*10⁹cells	558131

调节性T细胞的刺激与培养

机体内天然的Treg细胞数目很少，在小鼠体内，Treg细胞占CD4+T细胞的5%-10%，而人的只占1%-2%。因此，必须建立有效的体内外扩增方法，扩增出足够的Treg细胞才能满足临床应用。目前，Treg细胞的扩增方法主要有两种,一种是非特异性的，即利用CD3、CD28单克
隆抗体和外源IL-2刺激其扩增；另一种是特异性的，用同源或异源DC细胞进行扩增。而且，扩增以后的Treg细胞仍保持其原有的功能。

BD 调节性T细胞体外刺激与培养相关产品

名称	种属	包装	货号	名称	种属	包装	货号
T 细胞增殖刺激剂				活化剂
CD3 NA/LE 单克隆抗体	Hu	0.5 mg	555329	IL-2 重组蛋白	Hu	10 μg	554603
CD28 NA/LE 单克隆抗体	Hu	0.5 mg	555725	IL-2 重组蛋白	Ms	20 μg	550069
CD3e NA/LE 单克隆抗体	Ms	0.5 mg	553057	IL-10 重组蛋白	Hu	5 μg	554611
CD28 NA/LE 单克隆抗体	Ms	0.5 mg	553294	IL-10 重组蛋白	Ms	10 μg	550070
CD3预包被的96孔板	Hu	5/case	354725	TGF-β 天然蛋白	Hu	1 μg	354039
使用方法：将以上单抗包被于24 孔板或96 孔板中，用于刺激 T 细胞增殖				GM-CSF 重组蛋白	Hu	10 μg	550068
使用方法：将以上单抗包被于24 孔板或96 孔板中，用于刺激 T 细胞增殖				GM-CSF 重组蛋白	Ms	10 μg	554586

Treg的功能学研究相关产品

Treg通过抑制靶细胞IL-2的合成和下调抗原呈递细胞（APC）上的CD80和CD86表达发挥作用，也可能通过TGF-β等发挥作用：

APC表面标记分子：
人DC CD80/CD86/CD83
小鼠DC CD11C/CD80/CD86/CD40/MHC类分子
大鼠DC CD86/CD80

细胞因子检测：流式胞内细胞因子、ELISA、ELISPOT、CBA等方法
人： IL-10/TGF-β/IL-2/INF-γ/IL-4/IL-5/Il-17/TNF/IL-13
小鼠：IL-10/TGF-β/IL-2/INF-γ
大鼠：IFN- /IL-4/IL-6/TGF-β
CBA 产品：Human/Mouse/Rat Cytokine Kit及CBA Flex set

Treg细胞在临床上应用：Treg细胞用于自体干细胞移植

外周血来源的Treg细胞是在移植前18-20 天采集供者的造血干细胞（图左）。之后用磁珠分选或流式分选技术将CD8+、CD4+和CD19 +的非调节性T细胞群去除掉。此外，来自第三方的脐血无需负选（右），直接用CD25进行正选富集即可。收获的Treg 细胞群可以用抗CD3 和CD28 单克隆抗体进行体外刺激扩增或利用细胞基础抗原提成作用在K562细胞转染表达CD86和具有抗CD3 抗原表位的FcR（CD32或CD64的）进行扩增。在外周血Treg细胞中加入外源性IL-2、雷帕霉素和经照射的CD4+ CD25饲养层细胞进行扩增培养，而脐带血Treg细胞的扩增只需补充IL-2即可。完成质量控制后的Treg细胞在围造血干细胞移植期被注入患者体内，可与预防GVHD药物或T细胞单克隆抗体或体外T细胞去除一起联合使用。图中列出了每一步大概的细胞产量。

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干细胞精选试剂