BD CBA流式液相多重蛋白定量技术

BD CBA流式液相多重蛋白定量技术

——灵活、简便、高效定量、微量样本实现多重检测

虽然液相蛋白定量检测的技术很多，但是大多数的技术仅能对样本进行单一指标的检测，同时检测多个指标时则需要提供大量的样本分批检测，操作繁琐，且各指标间差异性较大。对于样本量较少或需要对比各指标的用户，传统的技术无法满足需要。日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析，由于这些因子的含量较少，低于一般常规方法的检测下限，使用常规的蛋白检测方法Western Blot等很难检测。为此，著名的流式抗体公司BD-Pharmingen开发了基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术——CBA。

【CBA工作原理】

Cytometric Bead Array（CBA）,即细胞因子微球检测技术.是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。

CBA的基本原理近似于ELISA的检测，即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。（如图1）

【详细原理介绍】

每个CBA微球大小一致，具有特定的荧光强度，包被有适用于特定分析（如其它抗体或者可溶性蛋白）的特异性捕获抗体（Capture Antibody），提供了类似ELISA孔板的捕获表面。当微球和待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或者细胞培养液）中相应的抗原或蛋白结合，然后加入荧光标记的检测抗体，就会形成“三明治”夹心复合物。（如图2）

最后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。CBA的每种微球携带有不同强度的红色荧光，在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对目的蛋白定性；检测抗体带有PE荧光素标记，在流式细胞仪的FL2通道检测，通过检测抗体的PE荧光强度定量目的蛋白。

【CBA技术特点】

CBA是集ELISA和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术。CBA的每一种微球提供一种蛋白的捕获表面，捕获微球与待测样品后，呈悬浮态，与ELISA相比，能更有效地捕获被分析物；CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点，对样本需求量更少，检测更快速、更准确。下面我们介绍一下CBA主要的技术特点:

1、轻松实现多重检测

最多可同时对一个样本中的75个目的蛋白进行精确定量。

2、样本需要量小

仅需要50μL溶液就可进行一次检测。

3、更高的灵敏度

分析灵敏度高达2.8pg/mL

4、更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性

CBA技术使蛋白定量的分析灵敏度高达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml，所有分析只需一组标准曲线。根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量，排除了ELISA反应中酶联放大产生的假阳性。

5、检测对象的灵活组合—BD CBA Flex Set

CBA kit是同时检测试剂盒配好的6个指标，形式比较固定。为满足不同客户的实际需要和研究兴趣，BD于2005年初推出了CBA Flex set。它改变了CBAkit的固定形式，成为自由组合、灵活搭配的“自助餐”。您可以根据需要组合不同的捕获微球来检测多个指标，最多能同时检测75个指标。

除了拥有CBA kit的优势外，Flex Set还配有独立的软件分析系统（CBA Flex Set Analysis Software），并且可以在BD FACSArray Bioanalyzer上，直接用96孔和384孔板进行操作。

CBA Flex set赋予研究者更灵活、更自由，更大的选择空间，而且进一步丰富了CBA产品线。种类涉及免疫、细胞信号传导、细胞凋亡等许多领域的蛋白定量分析。

6、操作简单，省时省力

CBA技术采用芯片式集成测定，所有检测只需一组标准曲线，就可计算出每种待测蛋白浓度；操作简单，整个流程只需要3.5小时，对待测样本可做实时分析，缩短检测了时间，提高了检测效率。

7、强大的软件分析系统

BD CBA软件具有强大的数据处理能力，直接将目标蛋白的检测结果换算成标准浓度；除了为用户提供待测物的计数结果外，还能提供可视轮廓或信号图形以帮助用户获得更多的信息。有用于Macintosh和Microsoft系统两种版本供您选择。

和传统的液相蛋白定量技术相比，CBA技术是一种“多元”和“同步”的检测技术。革新的CBA技术与传统的蛋白定量相比有下列优点：（表1）

传统ELISA	BD CBA
单项检测	多参数检测
每项实验样本用量50-200ul	样本用量少于50ul
需要抗原包被	操作方便，节省时间
实验时间大于24h	流式细胞仪自动检测，标准曲线自动测定，专用软件自动计算
酶-底物背景干扰	无酶-底物背景干扰

【产品应用】

自CBA上市以来，越来越多的科研和临床研究人员将CBA应用于他们的领域。CBA应用领域涉及眼泪、血清、唾液、细胞培养上清等样本中细胞因子、炎症因子的水平的分析。CBA还用于细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白分析，系统性红斑狼疮（SLE）和新生儿脓血症等免疫疾病的监控，肿瘤研究，药物对病人的治疗效果评估，药物研发，疫苗研究，总体免疫功能分析等多领域。

CBA产品信息见下表:

1、现有CBA Kit产品

Cat.#	产品描述	试剂盒检测指标
557800	Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-γ
560485	Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A, IL-10
551287	Mouse Th1/Th2 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ,TNF
552364	Mouse Inflammation Kit	IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70
550026	Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit	Heavy and light chain isotypes of mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, and IgE
560484	Human Th1/Th2/Th17 Kit	IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A
550749	Human Th1/Th2 Cytokine Kit	IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-g
551809	Human Th1/Th2 Cytokine Kit II	IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g
551811	Human Inflammatory Cytokine Kit	IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70
552990	Human Chemokine Kit	IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10
561418	Human Anaphylatoxin Kit	C3A,C4A,C5A

2、现有CBA Flex Set产品

Human		Mouse	Rat
IFN-γ,INF-α IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL- 23p40 TNF,TNFRⅠ,TNFRⅡ IP-10 I-TAC MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β Eotaxin RANTES CD54(ICAM-1) CD62E,CD62P,CD62L CD106(VCAM-1) sCD40 sCD154	sCD121a,sCD121b Soluble CD14 Basic FGF VEGF Angiogenin G-CSF,GM-CSF LIF LT-α OSM Granzyme A, Granzyme B Fas Ligand(FasL) Fractalkine IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, Total IgG,	IFN- γ IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL- 23p40, TNF MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β RANTES KC CD62E(E-Selectin), CD62L(L-Selectin) G-CSF,GM-CSF	IFN- γ IL-1 α, IL-4 , IL-6, IL-10 TNF

Human		Mouse	Rat
IFN-γ,INF-α IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL- 23p40 TNF,TNFRⅠ,TNFR<, SPAN style="FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-fareast-font-family: 宋体; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">Ⅱ IP-10 I-TAC MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β Eotaxin RANTES CD54(ICAM-1) CD62E,CD62P,CD62L CD106(VCAM-1) sCD40 sCD154	sCD121a,sCD121b Soluble CD14 Basic FGF VEGF Angiogenin G-CSF,GM-CSF LIF LT-α OSM Granzyme A, Granzyme B Fas Ligand(FasL) Fractalkine IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, Total IgG,	IFN- γ IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL- 23p40, TNF MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β RANTES KC CD62E(E-Selectin), CD62L(L-Selectin) G-CSF,GM-CSF	IFN- γ IL-1 α, IL-4 , IL-6, IL-10 TNF

3、CBA Flex Set产品-信号蛋白

Phospho Akt1(S473)	Phospho Akt2(S474)
Phospho BLNK (Y84)	Phospho p120 Catenin(Y228)
Phospho Btk (Y551)	Phospho MEK1/2(S222)
Phospho eNOS (S1177)	Phospho Paxillin(Y118)
Phospho ERK1/2 (T202/Y204)	Phospho Pyk2(Y402)
Phospho Itk (Y511)	Phospho SLP-76(Y145)
Phospho JNK1/2 (T183/Y185)	Phospho c-jun(S63)
Phospho p38 (T180/Y182)	Phospho stat3
Phospho PLC (Y783)
Phospho Rsk (T573)
Phospho Stat1 (Y701)
Phospho Syk (Y352)
Phospho ZAP70 (Y319)	Human Rex-1 Flex Set 干细胞
Total Stat1	Human Oct-4 Flex Set
Total Syk	Human Nanog Flex Set
Total ZAP70