可能很多老师在分析数据的时候都有想过，流式图该把门圈在哪里才比较靠谱？尤其是那些分群不明显的结果，画门位置就是最大的苦恼。
做流式我们知道几种常见的对照：
1.空白对照（未染色细胞）；
2.单阳对照；
3.同型对照；
4.FMO对照；
5.生物对照。
了解这几种对照的正确用法基本可以使流式数据的分析更客观更准确。接下来罗工就和大家聊聊这几种对照的用法↓。
空白对照
作用：作为电压调节的参考，上机调电压的时候先要用空白管上机，调整电压参数使细胞信号在图上各个通道的合适位置；同时也是可以看到细胞的本底信号，圈门时直接排除。
但我们有时候会发现，常规的未染色管（空白对照）似乎不足以帮助我们确定圈门位置，如下图案例展示。这是什么原因呢？
首先，图上空白是未经药物处理的空白细胞，但是高浓度药物很可能会增加细胞的本底荧光信号，如果还按照未处理细胞圈门，可以从分群情况明显看到门不太适用于该样本。这种情况就要注意空白细胞的选择要合适，最好是与实验组经过相同处理的细胞，比如做了固定破膜、加了药物处理等，也就是除了不加抗体，其他处理都一致，这样本底信号的排除才更加准确。
单阳对照
单阳对照，也就是单染对照。
作用：做单染调补偿是其主要作用，也可以协同调电压，防止阳性信号超出接收范围。
单阳对照，很多老师都有疑惑，我们现在把问题一一罗列出来。
1.做单染的细胞如何选择，可以混合细胞做吗？
2.单染阴性阳性信号分不开？
3.做单染的细胞数量不够？
4.单染调完补偿应用到样本上不适合？
解决上述问题我们首先要了解做单阳管的基本原则。
·单阳细胞阴阳群背景信号要一致，不能混合细胞做单阳；
·单阳信号要要阴阳分群明显，足以判断补偿是否合适；
·单阳染的荧光抗体，荧光要跟样本一致，不能用同通道其他荧光代替；
·单阳收集记录的events数要足够，避免因数据太少导致补偿计算差异太大。
因此，单阳可以用细胞，也可以用补偿微球（详情参看罗工秘籍42），但是不能混合在一管染，细胞也最好是跟样本接近的类型，不要两种相差很大的细胞混合在一起做（如药物处理和未处理的细胞混合做单阳）; 如果细胞单染阳性分群不明显，可以选择相同荧光素的高表达marker抗体染细胞（如foxp3/AF647用CD8/AF647抗体代替做单染），也可以用补偿微球代替细胞做单染；收集记录的单阳数据至少要5000以上，确保后续补偿值计算的准确性。
同型对照
作为排除背景荧光的对照，试用同型对照可以更准确的排除假阳性，也能帮助验证抗体的特异性。
作用
1.看荧光染料与细胞的结合问题；
2.看抗体FC段与与细胞FCR的结合；
3.看抗体与细胞的其他非特异结合。
举个例子：参考空白圈的会有部分非特异染色，参考同型圈阳性，就把这部分非特异排除了。
很多验证抗体的特异性也会用同型做QC，比如BD官网的QC图基本都要用同型来做,如下图(图来自BD官网)↓
或者结合指标抗体与同型抗体一起看某抗体的特异性，如下图看CX3CR1抗体的特异性(图来自流式中文网)↓
但是，有些时候我们会发现，同型抗体不适用了，因为同型对照的阳性已经比实验管的阳性高了，已经很难判断真正的阳性比例。这个时候我们首先要排除是否选错同型抗体，因为同型抗体的选择有几个基本原则：与目标抗体同宿主来源、同亚型、同荧光素、同蛋白浓度。然后就要看抗体的非特异结合问题。我们来看一下FC段与细胞FCR的非特异结合影响有多大(图来自流式中文网)↓。
可以看出，IgG1和IgG2a亚型的抗体跟细胞的非特异结合比较强，加了FCR阻断剂之后就好很多，FCR阻断剂可以避免大多数非特异染色，也就是用了FCR之后基本可以不用再做同型对照了。
FMO对照
对于FMO对照可能很多老师比较陌生，我们在做多色panel的时候，可能会发现一些通道信号特别难看，不好区分，可能就是某个荧光对该通道干扰很大，我们就可以用FMO对照（荧光扣除对照，抗体减一）来找到是哪个荧光的影响，这是它的用途之一；
另外一个用途就是，可以作为某些指标的阴性对照，排除全染的背景影响，帮助我们更准确地圈门。如下图所示↓。
用FMO去画门会比空白对照画门更加准确，有些分群不明显，或表达不高的的指标都可以做FMO对照去作为画门参考。
生物对照
这个就是在我们做一些样本处理时就要设置好的Control组，或者增加一些生物指标做参考，来判断实验处理的效果如何。
做刺激处理的时候为了确定刺激效果，就可以做一下未刺激的对照，看相应的细胞因子检测情况，如下图所示↓。可以去排除一下是刺激剂问题还是抗体染色问题。
以上就是我们做流式，需要掌握的对照设置问题，做好对照，才能排除分析过程中遇到的各种疑问，分析的结果也会更加客观有效。
