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免疫细胞培养通关技巧之样本制备

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免疫细胞(immune cells)是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞,包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等,其在免疫细胞疗法中扮演着至关重要的角色。免疫细胞疗法,即通过采集身体中的免疫细胞,经过体外培养,扩增,最后回输到体内,来增强机体对疾病的抵抗能力。因此免疫细胞培养至关重要。为此,小优创建了《免疫细胞培养通关技巧合集》,将为大家详细地介绍免疫细胞培养的六个基本流程:样本制备、细胞分选、分型鉴定、扩增&培养、质量优化、后续研究。今天我们先一起学习样本制备!

首先,我们需要认识一下免疫细胞。按照来源,免疫细胞可分为髓系和淋巴两类。骨髓是各类血细胞(包括免疫细胞)的发源地,骨髓中的造血干细胞具有高度自我更新能力和多能分化潜力,在骨髓造血微环境的影响下,经过定向祖细胞。前体细胞等分化阶段,最终分化成熟为各种血细胞(包括免疫细胞)(图1)。了解免疫细胞的分化历程及相关的细胞因子是十分重要的,有助于我们在扩增&培养阶段根据细胞的类型添加不同的生长因子,从而满足细胞的营养需要。

 

图1 免疫细胞的分化历程及相关细胞因子(图片来源于网络)

 

除此之外,我们也要了解免疫细胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例,如此,我们才能选择目的免疫细胞相对富集的样本进行单细胞悬液的制备。以下列举了人外周血,小鼠脾脏、外周血和淋巴结中免疫细胞的比例,供大家参考(表1和表2)。

 

表1 人外周血免疫细胞的比例

表2 小鼠脾脏、外周血、淋巴结免疫细胞的比例

 

做好以上的知识准备后,就来到我们的样本制备啦!

在正式的样本制备之前,我们还需进行样本采集和预处理。根据目的免疫细胞的分化以及血液和免疫器官分布,选择合适的样本,新鲜取材,并进行相关的预处理

血液:从血液中制备PBMC是分离特定免疫细胞亚群的一个常见方法。采集血液样品后,要装入含适当抗凝剂的容器中防止凝集,并且血液要与抗凝剂充分轻柔混匀。不同的抗凝剂其抗凝原理略有不同,小优也为大家整理了常见抗凝剂的原理及优缺点(表3)。目前来说,适合后续免疫细胞培养的抗凝剂是肝素抗凝剂。

 

表3 常用抗凝剂汇总

实体组织:实体组织的预处理相对简单,主要是组织的清洗。使用培养基或PBS等清洗组织上残留的血液,并剔除相关的结缔组织,整合过程中也一定要保证无菌。

 

注意事项:

①样本的取材一定要新鲜无菌,这样才能保证细胞的状态。

②血液要与抗凝剂轻柔混匀,剧烈晃动可导致溶血。

③血液采集后,需进行检测以保证质量及无菌。

 

样本制备(Sample Preparation):免疫细胞的来源可分为血液和各种实体组织,由此,样本制备的方法则分为PBMC的制备和实体组织制备成单细胞悬液。

1、单个核细胞(PBMC)的制备方法主要是密度梯度离心,其原理为血液中各细胞成分的比重存在差异,利用比重为1.077、近于等渗的Ficoll分离液作密度梯度离心时,各成分将按密度梯度聚集。

具体步骤如下:

1.收集抗凝血,用PBS按照1:1的比例稀释,轻轻上下颠倒混匀;

2.在15 mL离心管中,先加入3 mL充分混匀的Ficoll液(1.077密度),再沿着管壁小心加入2 mL稀释后的血液,血液和Ficoll液分层明显为成功;

3.将样本小心转移到离心机,500 g离心25 min;

4.小心取出离心管,弃掉上层黄色的液体,吸取中间层的白色薄膜层,即为PMBC(如图2);

图片

图2 抗凝血中加入Ficoll后图示(左);离心分层后图示(右图)

1.用10 mL PBS洗涤获得的PBMC,250 g离心10 min,弃上清;

2.重复洗涤一次并重悬细胞备用。

 

注意事项:

①Ficoll和血液(现取现用)在实验前恢复至室温,防止Ficoll低温时密度增加和红细胞低温时聚集,以减少PBMC被红细胞污染。

②离心倾倒收获细胞前,也可先吸取采集或丢弃最上层血浆层,有助于减少细胞被血小板污染。

2、实体组织制备成单细胞悬液:传统的实体组织解离成单细胞悬液的方法有机械法、酶解法和化学法。小优也为大家整理了这三种方法的原理、适用范围及优缺点(表4)。

表4 组织制备单细胞悬液传统方法的区别

当然,传统的组织解离方法也不是完全分隔的,比如机械法和酶解法就可以组合使用,接下来,我们以制备脾脏单细胞悬液给大家举个例子:

脾脏单细胞悬液制备具体步骤:

1.取PBS清洗、且去除过结缔组织的脾脏组织,放在含冰冷PBS的培养皿中,将脾脏组织剪成约10mm3小块;

2.使用研杵将组织研磨成单细胞悬液或加入终浓度为100 µg/mL的DNAse I,室温孵育5 min;

3.将上述混合物转移至15 mL离心管中,4℃,500g,离心5 min;

4.弃上清,加入10 mL PBS洗涤,重悬备用。

 

注意事项:

①机械法处理组织时,应尽量轻柔,以免过度损伤细胞。

②使用酶解法时,消化时间不宜过短或过长,过短组织解离不充分,过长则影响细胞状态。

有的小伙伴要问了,酶的种类那么多,我怎么选择呢?这里给大家推荐一个非常好用的网站https://www.worthington-biochem.com/tools-resources/tissue-dissociation-guide,大家根据自己的样本选择后,可再进行预实验确定最佳的酶浓度和孵育时间,拿走不谢!

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大家是不是觉得到这里样本制备就是万事大吉啦,当然不是,在大多数情况下我们都需要对获得的单细胞悬液进行质量优化,包括但不限于:去除死细胞、碎片、细胞团以及红细胞裂解等等。这部分的内容,各位小伙伴可以参考《工欲善其事,必先利其器---单细胞悬液质量优化》

好啦,样本制备的内容就介绍到这里啦,下一个细胞分选,咱们不见不散!

 

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