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工欲善其事,必先利其器---单细胞悬液质量优化

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随着流式分析、细胞分选、单细胞组学、质谱流式等研究技术的蓬勃发展,单细胞也在肿瘤免疫学和神经生物学等多个领域成为大众的焦点,它能够很好地反映细胞的特异性和异质性。目前,组织(以肿瘤组织为例)制备成单细胞悬液的方法主要有机械解离法、酶解法和化学法(图1)。

 

图1 肿瘤组织制备成单细胞悬液的方法[1]

 

高质量的初始样本是实验成功的关键。然而如何在此基础上,进一步优化粗悬液,获得高质量的单细胞悬液呢?基于三者的原理以及适用范围等(表1),我们发现这些方法处理样本时,没有统一的标准。就机械法来说,每次实验研磨的力道稍有不同,对细胞造成的损伤也不一样,这样就很难保证实验的重复性。不仅如此,处理样本的过程中,细胞可能会出现“死亡、碎片化、粘连”的情况,甚至某些组织如脾脏、心脏等还存在“红细胞”这一干扰因素。

 

表1 组织制备单细胞悬液方法的区别

 

针对这些问题,我们“对症下药”,单细胞悬液质量优化的神兵利器主要有以下五种:

1、gentleMACS Dissociator:gentleMACS全自动组织温和处理器可快速、温和、安全、自动、便捷和标准化地将组织(如脾脏、肝脏、肿瘤、表皮等)处理成单细胞悬液,可谓是组织样本处理的绝好帮手。其包含全自动组织解离器、专利解离管和针对不同组织优化的解离试剂盒,以及预设软件程序在内的整体方案,实现对不同组织样本的优化解离,确保细胞的活力、功能和表面表位的完好。能够确保每一次解离都在优化条件,同时解放双手,结果也可以轻松重复。

2、预分离:粗悬液中的细胞团块会导致细胞的不完全标记或增加非特异性结合标记而分离得到许多非目的细胞。不仅如此,在一些后续的细胞培养过程中,细胞团块也会影响细胞的最佳状态,影响实验结果。因此,我们可以在粗悬液制备后对其进行预分离,利用细胞滤器或筛网等,去除粗悬液中的细胞团块。

3、死细胞去除:在二代测序,细胞分选等下游实验中,死细胞将影响结果的准确性和有效性。死亡的细胞易裂解导致其中的RNA释放出来,会导致检测的背景噪声,进而影响单细胞数据的质量。此外,在细胞分选中,死细胞会影响捕获细胞计数的准确性,不利于下游的细胞培养和功能验证等实验。需要注意的是,当细胞活率<30%时,不建议进行此项操作,去除死细胞后,细胞活率虽然达到90%以上,但大部分细胞都已经死亡,细胞类型及分群会改变。

图2 经热休克处理的外周血单核细胞(PBMC)死细胞去除前后细胞分群比较[2]

 

4、去除碎片:机械解离的研磨,酶解法的吹打,甚至是离心过程,都可能会产生细胞碎片。样本制备过程中产生的细胞团、细胞碎片等会增加微流体芯片的堵塞风险,也会增加流式等实验中细胞的非特异性标记。我们可以通过严格控制上述操作的精度和力度来减少细胞碎片(难度较大),也可以使用细胞碎片去除试剂盒来优化(方便快捷)。

图3 成年大鼠心脏组织单细胞悬液去除碎片前后细胞群比较[2]

 

5、红细胞裂解:诸如脾脏、心脏、肝脏等制备单细胞悬液都会涉及到红细胞的裂解。红细胞过多会导致有效细胞识别不准确、有效细胞-非细胞界限模糊、有核率低等问题。

图4 成年大鼠心脏组织单细胞悬液(已去除碎片)进行红细胞裂解前后比较[2]

 

相信有了这些法宝,小伙伴们一定能够获得高质量单细胞悬液(表2),顺利开展实验啦!

 

表2 高质量单细胞悬液质控标准

 

文中相关产品:

货号 名称
130-093-235 gentleMACS™ Dissociator
130-098-458 MACS® SmartStrainers (30 µm)
130-098-462 MACS® SmartStrainers (70 µm)
130-098-463 MACS® SmartStrainers (100 µm)
130-090-101 Dead Cell Removal Kit
abs7233-1箱 100um细胞筛网(160目,黄色)
abs7231-1箱 40um细胞筛网(300目,蓝色)
abs7232-1箱 70um细胞筛网(200目,白色)
130-109-398 Debris Removal Solution
130-094-183 Red Blood Cell Lysis Solution (10×)
abs9241-100mL 红细胞裂解液(10×)

 

资料来源:

[1] Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):347-54.

[2]美天旎官网

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