Naveni® PLA技术历史回顾
Navinci 是一家瑞典生物技术公司，是邻近连接技术 （Proximity Ligation Assay，PLA)的先驱，专门开发用于研究蛋白质相互作用的创新解决方案。
2020年Navinci公司将Proximity Ligation Assay（PLA）技术进行了更新，命名为：Naveni® Proximity Ligation Technology，此技术基于一项新的UnFold 专有技术，与传统PLA技术相比，实验过程更加有特异型并且灵敏，主要更注重抗体的选择。
蛋白质研究过程中的挑战：
蛋白质在细胞中主要通过修饰、形成动态复合物等方式来执行其功能，但这些过程无法通过基因组学、转录组学或常规免疫染色方法来研究；组织是复杂的多细胞结构，荧光标记的检测试剂在组织中会发生非特异性结合。
解决方案
Naveni® PLA技术，可对蛋白质及其相互作用进行准确原位研究，检测内容包括：
-蛋白-蛋白互作
-同时检测游离蛋白和相互作用蛋白（PPI）
-蛋白质翻译后修饰（PTM）
-在保留细胞和组织结构的情况下精确定位蛋白质
-可生成且观察到被背景遮挡的信号，提高检测灵敏度
技术优势
可视化蛋白互作检测技术（提供干净、高分辨率的图像，且可进行量化）
目标蛋白的存在信号放大（信号强度增强）
可检测含量极低的蛋白质互作（微弱互作）
灵敏度高、特异性强
不受显微镜分辨率的影响
Naveni® PLA工作原理
1）封闭样本
2）一抗孵育：两种一抗分别与位于一种蛋白质或两种邻近蛋白质上的目标表位结合
3）Navenibody孵育：Navenibodies（与专有寡核苷酸臂结合的精选抗体）与各自的一抗结合
4）DNA circle形成：当 Navenibodies 靠近时，附着的寡聚物能形成 DNA circle，通过减少非特异性背景染色来保证高特异性
5）扩增和检测：加入聚合酶后，就会启动滚环循环扩增过程。标记的探针与扩增的DNA结合，显色形成亮点
已有报道证实 Naveni® PLA实力
在“Improved efciency of in situ protein analysis by proximity ligation using UnFold probes”中，作者将更新后的Naveni® PLA技术与常规的PLA技术进行实验对比，结果更加灵敏，有更强的信号生成。Naveni® PLA技术主要是在于二抗里面探针的更新，命名为：UnFold 探针。
两者实验原理有哪些不同？
图 1. 使用传统探针和 UnFold 探针进行PLA的示意图。(a) 传统PLA。(b) 使用 UnFold 探针的PLA反应。(i) 在一对一抗体结合了一对相互作用的蛋白质（红色和绿色）并经过洗涤后，加入二抗常规或 UnFold 原位PLA探针，孵育后再次进行洗涤。(ii) 在(a)中的传统设计中，再加入两个可形成 DNA 圈的寡核苷酸。使用 (b) 中的 UnFold 设计，携带发夹环寡核苷酸的探针在 U 残基处被裂解，释放出可与同一条 DNA 链的 3′端连接的自由 5′端。与此同时，另一条 UnFold 探针的发夹 DNA 链上的 U 残基也被裂解，从而产生一个单链模板，供酶连接第一条 UnFold 探针上的链的末端。(iii) 加入 DNA 连接酶，在两种原位聚乳酸变体中形成 DNA 圈。(iv) 最后，加入 phi29 DNA 聚合酶，以其中一种抗体上的寡核苷酸为引物启动 RCA，并用荧光寡核苷酸来观察 RCA 产物。
*滚动循环扩增（RCA）是一种基于环状DNA模板的恒温核酸扩增技术。
结果如何？
用福尔马林复染的parafn-embedded（FFPE）材料，作者分析了皮肤组织切片中 E-cadherin与β-catenin之间的相互作用。最后结果显示在表皮中产生了特异性的聚类信号（图 5）。与传统的原位PLA相比，UnFold探针在表皮中的信号数量更多。
图 5. 皮肤组织中 β-catenin 和 E-cadherin 相互作用的可视化。
接下来，作者比较了使用传统PLA探针或 UnFold 探针检测磷酸化蛋白的效率。用血小板衍生生长因子-BB (PDGF-BB)饥饿或刺激永久化的成纤维细胞 BJ hTert。使用抗-PDGFR 和抗-pan 磷酸化（pY100）作为一抗，两种设计的二抗-寡核苷酸共轭物都能检测到受刺激细胞中 PDGFR-β 磷酸化的增加（图 6a）。结果表明，与传统的原位聚乳酸相比，UnFold 设计在信号方面有明显的不同。
图 6. BJ hTert 细胞中 PDGFR-β 磷酸化的可视化。
(a）通过检测 PDGFR-β 的磷酸化水平（抗 PDGFR 和抗 pan 磷酸化 (pY100) 抗体），比较血清饥饿的 BJ hTert 细胞（-）和经 PDGF-BB 处理 45 分钟的冰冻细胞（+）。Te RCA 产物用 Cy3 标记（合并图像中的红点），细胞核用 Hoechst 33342 染色。比例尺（白色）=50 µm。(b) 比较不同探针浓度下传统 PLA 和 UnFold 原位 PLA 的信号定量。
Naveni® PLA技术在神经科学中的应用
图注：长时间去极化会导致 GluA1-Shank3 相互作用减弱。（Ross & Eizenman, Neurosci. Lett. 2023）
Shank3 基因缺失与 ASD 有关
Shank3 通过与谷氨酸受体相互作用来调节突触结构
通过共质谱（co-IP）和聚合酶链反应（PLA）（NaveniFlex），证明 GluA1 与 Shank3 直接相互作用。
长时间的细胞外 KCl 升高会降低 GluA1 -Shank3 的相互作用。
Naveni® PLA技术在前列腺癌机制研究中的应用
背景介绍：是关于雄激素受体（AR）突变与前列腺癌和雄激素不敏感综合征的关联，这些突变可能会深刻影响AR的结构、蛋白质相互作用网络和与染色质的结合，从而导致转录特征和药物反应的改变。然而，目前的结构信息无法解释病理突变对AR结构-功能关系的影响。
研究思路:是通过结合X射线晶体学、体外、体内和计算模拟等方法，深入研究跨越AR配体结合结构域（AR-LBD）完整二聚体界面的选定突变对AR依赖的转录和抗雄激素反应的影响。
研究结果：这些变体通过诱导AR-LBD中一个先前未描述的构象开关，增加了一个重要甲基化靶点Arg761的暴露，从而改变了AR的转录和抗雄激素反应。研究还证实了残基Arg761和Tyr764对AR二聚化和功能的重要性。这些结果揭示了AR二聚化和翻译后修饰的构象耦合作为一种疾病机制，并对精准医学具有重要意义。
文中的PLA实验：
试剂：NaveniFlex Cell MR Atto647N（一抗：鼠，兔）
蛋白互作检测： FL AR（全长雄激素受体） 和 内源性 PRMT5 （蛋白质精氨酸甲基转移酶5）
步骤：根据PLA实验步骤进行，当相近的 Navenibodies （二抗）相互作用时，分别与相近的荧光探针（ATTO647）进行 DNA 杂交和扩增，在经过洗涤、培养、封片后，将载玻片在 4°C 黑暗中短期保存，或在蔡司荧光显微镜下观察，并使用 ImageJ 软件对至少 300 个细胞的相互作用进行计数。
来自Andrea Alegre-Martí et al. ,A hotspot for posttranslational modifications on the androgen receptor dimer interface drives pathology and anti-androgen resistance.Sci. Adv.9,eade2175(2023).DOI:10.1126/sciadv.ade2175
实验结果：在 PC3- WT 和 PC3-Q799E 细胞中，AR-PRMT5 之间的相互作用很强，而在 PRMT5 受抑制的细胞中，这种作用明显减弱（图 A 和 B）；还显示了 FL AR 的精氨酸单甲基化以及较弱的对称二甲基化，在与 PRMT5 特异性抑制剂 GSK595 培养后，这种二甲基化减少了 50%（图 D 至 F）；
在所有 PLA 实验中，我们观察到了不同的模式，一些细胞核显示出强烈的 AR-PRMT5 或甲基化信号，而另一些则几乎没有这些信号（图 A 和 C）。我们还注意到，在这些实验中，Q799E 突变体的水平明显较低。
Naveni® PLA技术在细胞信号传导中的应用
背景介绍：是关于EGFR 和 PDGFR在 细胞内的内吞和信号传导过程中，与胆固醇的关系。探究膜鞘对表皮生长因子受体（EGFR）信号传导的作用，并比较其与血小板源性生长因子受体（PDGFR）的差异。
研究问题：是EGFR和PDGFR在内化和信号传导过程中是否存在差异，并且这些差异是否与胆固醇的耗竭有关。
解决思路：研究使用了BJ-hTERT细胞系，并通过使用甲基-β-环糊精（MbCD）来降低细胞中的胆固醇水平。通过Western blot分析EGFR的激活和下游信号传导，发现胆固醇的耗竭导致EGFR的磷酸化水平显著增加，并且EGFR的二聚化也增加。然而，在PDGFR的研究中并没有观察到类似的效应。此外，胆固醇的耗竭还导致AKT和ERK1/2的磷酸化水平显著降低，但对EGFR和PDGFR的影响不同。 为了进一步研究EGFR和PDGFR的内化和传导差异，研究使用免疫荧光显微镜观察了两种受体的转运。结果显示，在EGF和PDGF-BB的共同刺激下，EGFR和PDGFR-b的共定位程度较低。这表明在配体刺激后，两种受体在内化和传导过程中存在差异，并且这些差异与细胞膜中的胆固醇含量有关。这些发现有助于深入理解细胞信号传导的调控机制，并为进一步研究相关疾病的治疗提供了新的思路。
文中的PLA实验：
试剂：NaveniFlex Cell MR Red（一抗：鼠，兔）
蛋白互作检测：EGFR 和 PDGFR -b
步骤：将 BJ-hTERT 细胞接种到 8 孔室载玻片中，在饥饿培养基中饥饿过夜，然后分别用 20 ng/ml EGF 或 20 ng/ml PDGF-BB 刺激 0、5、15 或 45 分钟。然后按照免疫荧光显微镜部分的描述固定细胞并使其通透。然后按照Navinci说明书进行PLA实验。使用蔡司成像仪 M2 显微镜和 Zen 2（蓝色版），使用 40X/1.4 或 63X/1.4 油性物镜和 Hamamatsu C11440 相机。样品激发使用 HXP 120 V 光源（90% 强度）。
图 3 所示。EGFR 和 PDGFR 都通过网格蛋白包被的凹坑内化，但在不依赖网格蛋白的内吞途径中偏离。为了研究 EGFR 和 PDGFR-b 内化途径的潜在差异，在 20 ng/ml EGF 或 PDGF-BB刺激后，使用近距离结扎法(PLA)研究了它们与网格蛋白或小囊蛋白-1 的共定位。Clathrin 与 EGFR 或 PDGFR-b 的共定位如图(A 或 C)所示，并分别在(B 或 D)中进行量化。Caveolin-1 与 EGFR 或 PDGFR-b 的共定位分别显示在(E 或 G)和(F 或 H)中。细胞核为蓝色，PLA 滚圈扩增产物(RCP)为绿色。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。（来自Activated EGFR and PDGFR internalize in separate vesicles and downstream AKT and ERK1/2 signaling are differentially impacted by cholesterol depletion）
Naveni® PLA技术在卵巢癌预后中的检测应用
（Heinzl, Nicole et al. “Amyloid-like p53 as prognostic biomarker in serous ovarian cancer-a study of the OVCAD consortium.” Oncogene vol. 42,33 (2023): 2473-2484. doi:10.1038/s41388-023-02758-8）在浆液性卵巢癌中，p53 聚集是独立的预后标志，基于p53聚集体数量的来验证P53靶向疗法可改善患者预后。基于PLA的原理，只有当p53和淀粉样抗体近距离结合时，才会产生荧光信号。因此，PLA结果表明p53确实以低聚聚集体的形式存在，信号数与ELISA结果一致。且可以应用在FFPE样本上，PLA是一种有前途的潜在诊断手段。
图注：Proximity ligation assay (PLA) to demonstrate the presence of oligomeric p53 (white dots indicate the close proximity of the A11 and p53 antibody = presence of p53 aggregates, green = pan-cytokeratin, blue = nuclei, ×60 magnification, scale bar = 20 µm).
Naveni® PLA技术在动脉粥样硬化中的检测应用
背景信息：在动脉粥样硬化斑块形成过程中，平滑肌细胞（SMCs）从收缩/分化表型转变为合成/去分化表型。作者从猪冠状动脉中分离出分化的梭形(S)和去分化的菱形(R) SMCs。R-SMCs表达钙结合蛋白S100A4。研究了apelin在这种表型转化中的作用，以及它与S100A4的关系。作者发现，与S-SMCs相比，apelin在R-SMCs中表达apelin高表达。已知可诱导向r-表型的转变，产生了apelin和S100A4的直接相互作用和核表达。
文中PLA实验：
试剂：NaveniFlex Cell MR （一抗：鼠，兔）
蛋白互作检测： S100A4 与 apelin 蛋白
显微镜：
使用 Axioskop 2 显微镜（卡尔蔡司，耶拿，德国）拍摄图像，该显微镜配备了平面 neofuar×20/0.50 物镜和高灵敏度、高分辨率彩色数码相机（Axiocam，卡尔蔡司），使用 Zen 2.3 软件（卡尔蔡司），并使用 Adobe Photoshop 进行处理。使用 QuPath 图像分析软件 0.4.3 版对 PLA 复合物/细胞进行定量。
结果显示：在PDGF-BB刺激下，S-SMCs（平滑肌细胞）的细胞核和细胞质中都可以检测到PLA apelin/S100A4复合物。这表明apelin通过影响S100A4的表达和定位，在SMCs的表型转变中发挥作用。（来自Apelin is expressed in intimal smooth muscle cells and promotes their phenotypic transition）
Naveni® PLA技术在抗肿瘤治疗中的应用
背景信息：eIF4F是一个由eIF4E、eIF4G和PABP三个亚基组成的蛋白质复合物，eIF4F的表达水平与肿瘤的恶性程度和预后有关。本研究检测病人样本中，在anti-BRAF和anti-MEK治疗中，检测eIF4F复合物的改变。
图注：在 vemurafenib 处理过或未处理过的细胞系中，通过近接试验 (PLA) 检测到 eIF4E-eIF4G 或 eIF4E-4EBP1 的相互作用。相互作用表现为红色斑点。（来自eIF4F is a nexus of resistance to anti-BRAF and anti-MEK cancer therapies）
PLA 显示：在anti-BRAF治疗中，eIF4F复合物形成比率在免疫应答的肿瘤中降低，在抗药性转移肿瘤中升高;
意义:
eIF4F 不仅能够作为先天( innate ) 和获得性( acquired ) 抗性的指示器，也能作为抗肿瘤治疗的靶标;
靶向 BRAF (and/or MEK) 和 eIF4F的联合治疗能够克服大多数在BRAF(V600)-突变型肿瘤中不断增加的药物抗性
图注：病人组织样本中eIF4F复合物的形成
a. PLA检测不同时间病人组织样本中eIF4E-eIF4G和eIF4E-4EBP1的相互作用
b.PLA 定量显示复合物形成比
图注：PLA技术检测7个病人肿瘤组织中eIF4F 复合物形成，vemurafenib或dabrafenib治疗前后，eIF4E与eIF4G 和eIF4E与4EBP1的相互作用，每个棕色的点状信号代表一个复合体。PLA技术在病理组织蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精确性;优于传统IHC实验，能够高质量建立病样组织标本库。
Navinci好物推荐
| 货号 | 名称 | 介绍 |
| NaveniFlex系列 | ||
| NC.MR.100.Red | NaveniFlex Cell MR Red | 用于细胞样本，根据一抗来源种属选择试剂搭配使用，一款试剂兼容两种一抗，包含TEX615、Atto647N荧光团检测 |
| NC.MR.100.Atto | NaveniFlex Cell MR Atto647N | |
| NC.GR.100.Red | NaveniFlex Cell GR Red | |
| NC.GR.100.Atto | NaveniFlex Cell GR Atto647N | |
| NC.GM.100.Red | NaveniFlex Cell GM Red | |
| NC.GM.100.Atto | NaveniFlex Cell GM Atto647N | |
| NT.MR.100.Red | NaveniFlex Tissue MR Red | 用于组织样本，根据一抗来源种属选择试剂搭配使用，一款试剂兼容两种一抗，包含TEX615、Atto647N荧光团检测 |
| NT.MR.100.Atto | NaveniFlex Tissue MR Atto647N | |
| NT.GR.100.Red | NaveniFlex Tissue GR Red | |
| NT.GR.100.Atto | NaveniFlex Tissue GR Atto647N | |
| NT.GM.100.Red | NaveniFlex Tissue GM Red | |
| NT.GM.100.Atto | NaveniFlex Tissue GM Atto647N | |
| Naveni TriFlex系列 | ||
| TF.MR.100 | Naveni Triflex Cell MR | 用于检测和定量蛋白A，B及二者相互作用；可与小鼠和兔的一抗配对使用 |
| NaveniBright系列 | ||
| NB.MR.HRP.100 | NaveniBright HRP | 一抗使用鼠、兔，使用HRP底物进行显色读数。明场下检测 |
| NB.MR.AP.100 | NaveniBright AP | 一抗使用鼠、兔，使用AP底物进行显色读数。明场下检测 |
| Naveni PTM系列-磷酸化 | ||
| NPT.EGFR | Naveni pY EGFR | EGFR磷酸化检测试剂盒 |
| NPT.MET | Naveni pY MET | MET磷酸化检测试剂盒 |
| NPT.HER2 | Naveni pY HER2 | HER2磷酸化检测试剂盒 |
| NPT.PDGFRB | Naveni pY PDGFR beta | PDGFR beta磷酸化检测试剂盒 |
| NPT.PVEGFR2 | Naveni pY VEGFR2 | VEGFR2磷酸化检测试剂盒 |
| NPT.PD1AP | Naveni pY PD1 AP | PD1磷酸化检测试剂盒（AP） |
| NPT.PD1HRP | Naveni pY PD1 HRP | PD1磷酸化检测试剂盒（HRP） |
| Naveni PPI系列-成品 | ||
| NPT.PDL1.AP.100 | Naveni PD1/PD-L1 AP | PD1/PDL1互作检测试剂盒（AP） |
| NPT.PDL1.HRP.100 | Naveni PD1/PD-L1 HRP | PD1/PDL1互作检测试剂盒（HRP） |
| NPT.PDL1.Atto647N.100 | Naveni PD1/PD-L1 Atto647N | PD1/PDL1互作检测试剂盒 |
| PPI.TCR01.FR.100 | Naveni® CD8/MHCI Atto647N | CD8/MHCI互作检测试剂盒 |
