TUNEL凋亡检测结合免疫荧光染色流程protocol
步骤一：石蜡切片的前期准备
1. 将切片置于65℃恒温箱中烘烤60分钟，以确保切片稳固。
步骤二：溶液配制（冰上操作）
在切片烘烤的同时，于冰上准备后续所需溶液。
步骤三：切片脱蜡与水化
2.切片依次通过二甲苯两次及梯度酒精（100%、95%、75%），每次处理5至7分钟，以彻底脱蜡并水化。
步骤四：PBS润洗
3. 立即将切片浸入1x PBS中，轻柔漂洗5-7分钟，防止切片干燥。
步骤五：Proteinase K处理
4. 向每个样本滴加100微升稀释后的Proteinase K，室温下孵育20分钟，以促进细胞通透性。
步骤六：检测组样本的PBS清洗
5. 检测组样本用1x PBS重复清洗三次，每次5分钟，以去除Proteinase K残留。
步骤七至九：阳性对照处理
6. 阳性对照组滴加100微升1x DNase I Buffer，室温平衡5分钟。
7. 使用1x DNase I Buffer以1:100的比例稀释DNase I。
8. 吸去平衡液，向每个阳性切片滴加100微升稀释后的DNase I，室温孵育10分钟，诱导DNA断裂。
步骤十：阳性对照的PBS清洗
9. 吸去DNase I溶液，将阳性对照组切片单独置于1x PBS中重复清洗三次，每次5分钟。
步骤十一：Equilibration Buffer平衡
10. 向每个样本滴加100微升1x Equilibration Buffer，室温下平衡20分钟，为TUNEL反应做准备。
步骤十二：TUNEL反应液配制与孵育（避光操作）
11. 在平衡期间，根据样本数量剪好封口膜，并在冰上避光配制TUNEL反应液。
12. 吸去平衡液，向每个样本滴加50微升TUNEL孵育液，覆盖封口膜。
13. 将样本置于含有湿纸巾的湿盒内，避光37℃孵育60分钟。
步骤十三至十五：PBS清洗与DAPI染色
14. 吸去TUNEL孵育液，用1x PBS重复清洗三次，每次5分钟。
15. 新鲜配制2μg/ml DAPI溶液（即1μg/μl DAPI溶液2μl溶于1ml 1x PBS）。
16. 吸去清洗液，向每个样本滴加50微升DAPI溶液，避光室温孵育5分钟。
步骤十六至十九：封片准备与封片
17. 配制20%甘油溶液（200μl甘油+800μl 1x PBS）。
18. 吸去DAPI溶液，向每个样本滴加100微升20%甘油溶液，并使用厚度小于0.7mm的盖玻片封片。
步骤二十：显微镜观察与分析
19. 立即在共聚焦显微镜下观察样本，设置520nm荧光通道观察FITC的绿色荧光，460nm荧光通道观察DAPI的蓝色荧光。
注意事项：
- 试剂盒通常仅包含FITC染料，DAPI需单独购买。
- 荧光染料易淬灭，应现配现用，并在操作过程中严格避光。
- 染色完成后，应尽快对切片进行拍照记录。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| TUNEL细胞凋亡试剂盒（绿色荧光） | abs50047-20T | 20T |
| Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒 | abs50022-50T | 50T |
| Caspase 3/7 活性检测试剂盒 | abs50025-20T | 20T |
