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CoIP实验常见问题

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免疫(共)沉淀(IP/CoIP)是基于抗体和蛋白的特异性亲和作用,通过捕获与蛋白或抗原特异性结合的抗体,进而从复杂的样品中捕获及富集目标蛋白,同时可以测定与之相互作用的蛋白或其它生物大分子。
 

CoIP原理图


CoIP实验对照的设置方法
常见的主要有三种方式,第一种是实验组转染诱饵蛋白和标签蛋白,对照组只转染标签蛋白,这种方法不仅可以提高诱饵蛋白的表达量,增加实验的成功率,而且标签抗体的成本低,亲和力强,但是毕竟不是本身生理状态下的表达量,和实际结果可能有出入,而且需要构建载体,更适用于诱饵蛋白表达量低或者没有IP抗体的情况;第二种是选择IP抗体的对照IgG抗体,这种方式下,诱饵蛋白的表达处于天然状态,更接近真实情况,但是相应的可能出现表达量低,成功率不高的情况,同时需要IP级别的抗体;第三种就是用敲除诱饵蛋白的细胞作对照样本,这种情况下,实验组也是在天然条件下,可信度高,但是实验所需的周期较高,要进行敲除验证。


CoIP试剂盒中样本裂解液可以用WB的裂解液替代吗?
不可以,CoIP的裂解液中一般不含SDS,SDS是一种强效的去垢剂,它能够破坏蛋白质之间的非共价相互作用,使蛋白质变性,这会导致原本相互作用的蛋白质复合体解离。


COIP样本裂解后蛋白浓度一般能达到多少?
不低于1mg/ml,如果蛋白浓度过高,可用pbs稀释。


琼脂糖珠中Protein A和Protein G 有何区别,都要加吗?
一般建议都加,Protein A与兔源抗体亲和力高,Protein G与鼠源抗体亲和力高。


抗体、样本、磁珠的加入顺序比较?
第一种抗体先于蛋白结合,再加入磁珠,第二种抗体先与磁珠孵育,最后加入蛋白,第三种同时加入,一般情况下第一种与第二种相差不大,如果蛋白量过高,比如大于1000ug,建议使用第二种,否则蛋白容易吸附在磁珠上,降低得率。


Input组要跑内参吗?
当然,Input组跑内参不仅可以协助判断操作,对样本是否降解也有提示作用


IP/CoIP结果判读及常见问题
1、CoIP结果如何判读?
 


IB:即免疫印迹,也就是常规的Western Blotting,用于显示目的蛋白。
IP:即免疫沉淀,这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。
Input:全细胞裂解液,含有细胞内所有的蛋白,可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞裂解液,在做IP实验之前,需要先跑WB,确认样本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A:A蛋白的免疫共沉淀抗体
IgG:Anti-A的同型对照抗体,即跟Anti-A同来源同种型,如Anti-A是兔来源IgG型,则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG(abs20035


结果图解析:
该结果是为验证蛋白A与蛋白B是否存在相互作用。本实验一共分为两大组:Input组及IP组,其中IP组又分为IgG组(阴性对照组)和实验组,并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。由Input组的条带可以得到结论:蛋白A与蛋白B都是存在的,证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验,结果蛋白A与蛋白B均没有条带,说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来,证明蛋白A和B与IgG没有结合,排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性;而实验组蛋白A和B均有条带,表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验,成功把蛋白A沉淀下来了,与此同时蛋白B也被沉淀下来,进而得到结论:蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。


2、input组无条带,IP组有条带
 


可能由于目标蛋白在样本中的丰度较低或存在降解现象,这导致在Input组中未能成功检测到该蛋白,而在IP组经过富集后能够检测到。建议适当提高Input组的上样量,进行常规的WB验证,并在样本处理阶段添加蛋白酶抑制剂以稳定蛋白质。


3、杂带问题
非特异性条带要分情况分析,如果是input和IP组、IgG组都有杂带,可能是磁珠的非特异性结合,样本上样量过高、或者抗体浓度过高造成的非特异性结合,建议实验前对磁珠进行漂洗,实验过程中增加洗涤次数,使用合适的样品和抗体浓度。如果IgG组和IP组无杂带,
Input有杂带,可能由于WB抗体的特异性不够好,实际实验中可能考虑的因素可能要更多。
 


4、IP和IgG组均无条带
可能由于IP抗体加入的量少,ip抗体特异性差,或者蛋白量过高,优先覆盖住beads,导致IP抗体和Beads的集合较少等,可以优先通过增加抗体用量和优化结合顺序入手,实在没有改善只能更换抗体进行尝试。
 


5、轻重链问题
 


在变性洗脱过程中,抗体在高温和还原剂的影响下分解为重链55KD和轻链分子25KD,当WB所用的抗体和IP抗体同源时,二抗就会识别到IP抗体的轻重链,这是比较常见的一个问题,在抗体选择时,尽量IP抗体和WB抗体来自不同种属,当然,即便已经做了这种优化,实验结果往往还是有轻重链,可能是由于二抗的特异性不够等原因,这种情况下可以采用IP专用的二抗,这种抗体只识别轻链或者重链,如果目的蛋白在轻链附近,选择只识别重链的抗体,或者对于WB实验,建议使用直标一抗,但需注意直标一抗可能因无二抗信号放大作用,而导致信号较弱或无法曝光的情况。
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