外泌体MicroRNA作为细胞间通讯的关键信使，不仅调控靶基因表达，还展现出作为疾病诊断生物标志物的巨大潜力。本文介绍了一种创新的芯片平台，集成了外泌体MicroRNA的扩增与检测功能，实现了快速分析。该平台由双流动池构成，分别专注于外泌体处理和MicroRNA检测，采用芯片上指数扩增反应（EXPAR）技术，实现了MicroRNA的精准定量。我们开发了便携式检测装置，结合低成本微流控技术，简化了EXPAR分析流程，并实现了荧光图像采集与扩增曲线分析。此外，我们还深入探索了不同表型巨噬细胞外泌体中的miRNA谱，为液体活检的床旁检测提供了有力支持。
发表在《Biosensors and Bioelectronics》的文献，文章题目为“A portable system for isothermal amplification and detection of exosomal microRNAs”
创新点：
1、技术融合创新：将微流控芯片与等温扩增技术巧妙结合，构建了高效的外泌体miRNA分析平台，能够精准区分源自相似细胞的外泌体miRNA特征。
2、检测优势显著：该系统实现了外泌体miRNA的快速、多路检测，具有成本低廉、一次性使用、检测时间短及无需复杂RNA提取等优点，为临床检测带来了革命性变化。
研究结果：
1、芯片设计与制造：成功设计出集成EV提取、裂解与miRNA检测的微流控芯片，并通过实验验证了其高效性。芯片结构紧凑，操作简便，为miRNA分析提供了强有力的工具。
芯片上外泌体 miRNA 分析测定示意图。(a)-(c) 分别为 EV 提取和裂解芯片、miRNA 检测芯片和 EXPAR 扩增曲线示意图。(d）抗 CD63 抗体包被磁珠通过 EV 表面 CD63 抗原与 EV 连接。(e) 在 95℃ 下裂解 EV 以释放外泌体 miRNA。(f) 使用特定寡核苷酸模板扩增和检测 miRNA 的等温 EXPAR 分析。
用于分析外泌体 miRNA 的流式细胞。(a)装配好的外泌体裂解芯片和 miRNA 检测芯片的照片。流道和反应室的深度分别为0.5毫米和1.5 毫米。(b)磁珠上捕获的外泌体的扫描电子显微镜（SEM）图像。外泌体用黄色标出。
基于loT的EXPAR仪器。(a) POT miRNA 分析系统的设计，尺寸为 54 毫米 × 54 毫米 × 54 毫米。(b) 带有温度控制组件的 miRNA 传感器芯片示意图。(c) 安装有 ESP32 微控制器、光学器件和电子元件的系统照片,3D 打印外壳中的系统照片。
2、EXPAR试验设计：构建了基于特定模板的EXPAR扩增体系，实现了目标miRNA的高效扩增与定量检测。通过优化实验条件，确保了检测结果的准确性与可靠性。
(a) EXPAR试验示意图，该试验利用特定模板、链置换聚合酶和裂解酶扩增目标 miRNA。EXPAR产物的数量可使用dsDNA 结合染料（如 SYBR-green）进行量化。(b) 四种目标miRNA 序列和相应的扩增模板。这些模板的3 ′端以磷酸基团（-Phos）终止。
3、芯片上miRNA定量分析：利用EXPAR技术，实现了miRNA的实时定量检测。通过测量荧光强度达到阈值的时间（Tt），成功建立了miRNA浓度与Tt值之间的线性关系，为miRNA的精准定量提供了科学依据。
在 EXPAR 定量检测中，通常用到阈值的时间（T t ）来确定 miRNA 的浓度。在这里，我们把荧光强度达到最大荧光值 20% 的时间定义为 T t。为了计算 T t 值，我们使用荧光检测器实时测量 EXPAR 反应产生的扩增子。选择 miRNA-223 来演示这一过程。配制10倍浓度梯度的 miRNA-223 稀释序列，miRNA 浓度从 100 nM 到 100 fM 不等。用移液管将稀释后的样品与作为阴性对照的空样品一起储存在反应室中。密封流动池后，将 EXPAR 试剂和ssDNA 模板注入芯片。每隔 30 秒测量一次所有反应室的荧光强度。图 5(a) 比较了 miRNA-223 在 15 分钟、20 分钟和 25 分钟扩增过程中采集的荧光图像。反应室荧光发射的增加与 dsDNA 扩增子的产生相对应。计算每个反应室的平均荧光强度，并绘制出时间与扩增时间的函数关系图，如图 5(b) 所示。T t 值的计算结果与 miRNA-223浓度的关系见图 5(c)。100 nM 和 100 fM 样品的 T t 值分别约为 15 分钟和 22 分钟。从线性拟合中可以看出，T t 值随着 miRNA 浓度的增加而成正比地降低。随着 miRNA 浓度的增加而成正比地降低。这种实时 EXPAR 数据采集和 T t 值分析的结果表明，传感器系统是完全定量的。传感器系统是完全定量的。接下来，我们制备并测试了十倍稀释的 miRNA-127、miRNA-146b 和 miRNA-210。miRNA 浓度从 100 nM 到 100 fM。图 5(d)-(f) 显示了 miRNA-127、miRNA-146b 和 miRNA-210 的 T t响应曲线。这些剂量反应曲线作为计算数据被用作研究巨噬细胞衍生 EV 中外泌体 miRNA 图谱的计算数据。先前的研究报告指出，平均每个 EV 颗粒可包含约 0.1-100 个拷贝的这些 miRNA。假设磁珠纯化的 EV 浓度为 6.42× 10⁸ EV/mL，则miRNA 浓度在10²-10⁵fM 之间，属于芯片 EXPAR 检测的灵敏度范围。
4、多miRNA同时检测：在芯片上实现了多种miRNA的同时检测，通过分别测定各miRNA的Tt值，并结合校准曲线，计算出了各miRNA的浓度，为复杂生物样本的分析提供了有力支持。
5、巨噬细胞表型miRNA图谱分析：通过对不同表型巨噬细胞外泌体中的miRNA进行图谱分析，揭示了miRNA表达与巨噬细胞表型之间的关联，为疾病诊断与治疗提供了新的视角。
同时检测三种巨噬细胞表型的 EV中多种miRNA 的含量。(a) EV M0 中四种不同 miRNA 的扩增曲线。(b) EV M0 所携带的每种 miRNA 的计算浓度。(c) 从 M0 到 M1 和 M2 巨噬细胞极化示意图。(d) 计算出的来自 M0、M1 和 M2 巨噬细胞的 EV 的 miRNA 浓度。
总结与展望：
未来发展方向：计划开发更高密度的反应室阵列，以扩大miRNA检测范围，提升检测通量。
降低成本与时间：致力于研发更低成本、更快速的miRNA表达谱检测方法，以满足临床诊断的迫切需求。
自动化与简化：借助高精度微流控技术，推动外泌体miRNA检测测定的自动化进程，并探索EXPAR试剂在流动池内的冻干技术，以简化检测流程，提升用户体验。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 外泌体 miRNA 提取试剂盒 | abs60565-50T | 50T |
| miRCURY LNA miRNA PCR Assay | 339306 | 1Kit |
| miRNeasy Mini Kit (50) | 217004 | 50Test |
