Runx2
肌成纤维细胞，主要由肝脏中被激活的肝星状细胞（HSC）构成，是肝纤维化进程中不可或缺的角色。鉴于肌成纤维细胞在细胞外基质蛋白的合成、积累及重构方面的核心功能，将HSC作为治疗靶点被视为一种新兴的肝纤维化治疗策略，并正日益受到临床前研究与临床试验的关注。尽管先前的探索已揭示了runt相关转录因子2（Runx2）与非酒精性脂肪性肝病的进展存在关联，但Runx2在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的确切作用机制仍尚待明确。
在2023年7月5日，重庆医科大学附属第一医院邓亮博士的研究团队在《临床与转化医学》（Clin Transl Med）期刊上发表了一篇题为“Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression”的研究文章。该研究聚焦于人和小鼠的肝星状细胞（HSC），借助RNA-seq和ChIP-seq等先进的分析手段，深入揭示了Runx2在肝纤维化进程中通过转录水平调控Itgav（整合素α-V）表达对HSC活化的关键作用。这一发现暗示了Runx2可能成为肝纤维化治疗的一个有潜力的靶点。
研究摘要
本研究的核心发现指出，在人肝纤维化中，不论病因如何，Runx2的表达均呈现显著上升趋势；同样，在小鼠肝纤维化模型中，Runx2的表达也随病程发展逐渐增强，且主要定位于活化的肝星状细胞（HSC）内。通过基因敲除技术阻断HSC中的Runx2表达，可以显著减轻由多种因素（包括CCl4、DDC诱导以及蛋氨酸胆碱缺乏症）引发的肝纤维化程度。相反，通过注射HBAAV-Runx2或VA-Lip-Runx2实现Runx2的过表达，则加剧了CCl4诱导的肝纤维化。
体外实验进一步证实，Runx2对HSC的活化和增殖具有促进作用，而敲除Runx2则抑制了这些效应。结合RNA-seq和ChIP-seq分析，本研究揭示了Runx2通过与整合素α-V（Itgav）启动子的直接结合，上调其表达水平。进一步的研究表明，阻断Itgav的表达能够有效减弱Runx2诱导的HSC活化及肝纤维化进程。
此外，本研究还阐明了细胞因子（如TGF-β1、PDGF、EGF）通过激活蛋白激酶A（PKA）信号通路，促进HSC中Runx2的表达及核转位的机制。
Runx2在肝星状细胞（HSC）活化及肝纤维化进程中的促进作用示意图
研究结果
（1）Runx2表达在不同肝纤维化样本中的上调情况：
（A）相较于对照样本，Runx2在GSE25097队列的人肝硬化组织（左侧）、GSE103580队列的酒精性肝炎或肝硬化的人肝脏组织（中间）以及GSE49541队列的不同纤维化阶段（FS）的人肝纤维化组织（右侧）中的mRNA表达水平均有显著上升。
（B-C）利用Western blot分析和qRT-PCR技术，检测了人非纤维化与肝硬化肝样品中Runx2的蛋白和mRNA表达水平（样本数=3）。
（D）从非纤维化与肝硬化患者中采集肝脏组织样本，并进行Masson组织学染色、α-SMA和Runx2的免疫组化（IHC）染色分析。使用ImageJ软件对阳性染色区域进行定量检测。比例尺：50μm（样本数=10）。
（E）与对照样品相比，Runx2在GSE31431小鼠肝纤维化组织中的mRNA表达水平同样有所上升。
（F-G）通过腹腔注射CCl4（5μL/G体重）的方式，诱导小鼠肝纤维化持续4周。随后，利用Western blot和qRT-PCR技术，分析肝脏组织中Runx2的蛋白和mRNA表达水平（样本数=3）。
（H）给小鼠喂食高脂肪饮食12个月，以诱导NASH相关纤维化。随后，通过IP注射CCl4诱导小鼠肝纤维化4周。对肝脏组织进行Masson组织学染色、α-SMA和Runx2的IHC染色分析。使用ImageJ软件对阳性染色区域进行定量测量。比例尺：50μm（样本数=6）。数据表示为平均值±SEM，*p、**p<0.05表示与对照组相比有显著性差异，#p＜0.01表示差异极显著；ns表示差异不显著。
（2）Runx2在活化HSC中的特异性定位及其体外活化过程中的时间依赖性增加
（A）通过免疫荧光显微镜观察CCl4处理的小鼠和肝硬化患者肝切片，对活化HSC（α-SMA，红色）、内皮细胞（CD31，红色）和Kupffer细胞（F4/80，红色）进行染色，同时显示Runx2（绿色）的定位。比例尺：小鼠为20μm，肝硬化患者为50μm（样本数=3）。
（B）对经olive或CCl4处理4周的小鼠进行原代HSC的分离，随后利用RNA-seq分析检测沉默HSC（qHSC，olive处理）和活化HSC（aHSC，CCl4处理）的基因表达差异，并通过火山图进行可视化。
（C）小提琴图展示了每个聚类中选定标记基因（Runx2、α-SMA和Col1a1）的相对表达水平；平均每个条件包含1000个细胞。
（D-E）从正常小鼠肝脏中分离出原代HSC，并在不同时间点（第1、4和7天）进行培养。通过Western blot和qRT-PCR技术检测Runx2、α-SMA、I型胶原（collagen I）和TGF-β1的蛋白和mRNA表达水平（样本数=5）。
（F）在指定时间点培养的原代HSC中，通过免疫荧光染色观察Runx2和α-SMA的表达情况，并展示高倍放大图像（样本数=3）。数据以平均值±SEM表示，与对照组相比，*p＜0.05表示有显著性差异。
（3）HSC中Runx2的特异性敲除可减轻CCl4、DDC或MCD诱导的小鼠肝纤维化
（A）构建小鼠HSC特异性Runx2敲除模型（Runx2△+HSC）的策略概览
（B-C）对HSC小鼠进行4周的olive或CCl4处理，随后采用Western blot和qRT-PCR技术，分析Runx2f+（野生型）和Runx2△+（Runx2敲除型）HSC中Runx2、I型胶原和α-SMA的蛋白质和mRNA表达水平（样本数=3）。
（D）展示olive或CCl4处理的Runx2f+和Runx2△+小鼠肝脏组织中I型胶原和α-SMA的Masson染色及免疫组化（IHC）染色的代表性图像。比例尺：100μm（样本数=5）。
（E）对Runx2f+和Runx2△+HSC小鼠进行0.1%DDC喂养4周以诱导胆汁淤积，或进行MCD喂养8周以诱导非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。展示α-SMA的H&E染色、Masson染色及IHC染色的代表性图像。比例尺：100μm（样本数=3）。
(4) Runx2的过度表达加剧了CCl4诱导的肝纤维化
（A）实验设计概览：为探究Runx2过表达对肝纤维化的影响，我们设计了以下实验。小鼠在接受HBAAV-ctrl（对照组）或HBAAV-Runx2（实验组，100μL/只，浓度1×10^12 V g/mL，通过门静脉注射）3周后，连续4周接受olive或CCl4的注射。
（B-C）蛋白和基因表达检测：利用Western blot和qRT-PCR技术，我们检测了Runx2、I型胶原和α-SMA的蛋白和mRNA表达水平（样本数=3）。
（D）组织染色分析：在olive或CCl4处理的HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中，我们对胶原I和α-SMA进行了Masson染色和免疫组化（IHC）染色，并展示了代表性图像。比例尺：100μm（样本数=5）。
（5）Runx2在体外对HSC活化的调控作用
（A）示意图展示Runx2△/△HSC小鼠的HSC特异性缺失策略：该策略旨在探究Runx2在HSC活化过程中的作用。
（B）原代HSC的分离与培养：从Runx2△/△HSC或HBAAV-Runx2小鼠中分离出原代HSC，并在含有3%胎牛血清（FBS）的条件下培养4天，以观察其活化情况。
（C）纤维相关基因的检测：利用qRT-PCR技术，测定从Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分离的原代HSC中纤维相关基因的表达水平。
（D）Western blot分析：对从Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分离的原代HSC进行Western blot分析，检测Runx2、α-SMA、I型胶原和TGF-β1的蛋白表达。
（E-F）mRNA和蛋白表达分析：通过qRT-PCR和Western blot技术，分析从HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中分离的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型胶原和TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平。
（G-H）流式细胞术分析：利用流式细胞术，分析原代HSC中各个细胞周期阶段的指数生长百分比，以评估Runx2对HSC增殖的影响。
（I）免疫荧光染色检测：对从Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分离的原代HSC进行免疫荧光染色，检测α-SMA的活化特征，以进一步验证Runx2在HSC活化中的作用（样本数=3）。
（6）Itgav作为Runx2在肝纤维化中的直接下游靶点
（A）RNA-seq分析：我们对使用Runx2或Scramble siRNA转染并培养3天的原代HSC进行了RNA-seq分析，随后对差异表达基因（DEG）进行了KEGG通路富集分析，以探究Runx2对HSC基因表达的影响。
（B）Runx2 ChIP-seq分析：从HBAAV-Runx2小鼠分离的原代HSC中，我们进行了Runx2的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）分析，并对DEG进行了KEGG通路富集分析，以揭示Runx2的潜在下游靶点。
（C）交叉分析：通过ChIP-seq分析，我们确定了348个与Runx2结合的基因启动子，并与183个TGF-β通路相关基因进行了交叉分析，以寻找Runx2与TGF-β通路之间的潜在联系。
（D）基因组图谱展示：我们展示了Itgav转录启动子区域的Runx2结合位点（位于Chr2:8372357-83723806），这进一步证实了Itgav作为Runx2下游靶点的可能性。
（E）荧光素酶报告基因分析：在转染了pCDNA 3.1-ctrl或pCDNA 3.1-Runx2的小鼠HSC细胞系上，我们进行了荧光素酶报告基因分析，以验证Runx2对Itgav启动子的直接调控作用。
（F-G）肝脏组织分析：从经CCl4处理4周的Runx2f/+、Runx2△/+HSC、HBAAV-ctrl和HBAAV-Runx2小鼠中采集肝脏组织，并通过qRT-PCR和Western blot分析Itgav的mRNA和蛋白表达水平。
（H-I）原代HSC分析：分别从Runx2f/f小鼠、Runx2△/△HSC小鼠、HBAAV-ctrl小鼠和HBAAV-Runx2小鼠中分离出原代HSC，并使用qRT-PCR分析Itgav的mRNA表达水平。同时，通过Western blot分析Itgav及其下游激酶（包括FAK、pFAK、PI3K、pPI3K、Smad2/3和pSmad2/3）的蛋白表达水平。数据以平均值±SEM表示；样本数=3，*p＜0.05表示与对照组相比有显著性差异，#p＜0.05表示与其他指定组相比有显著性差异。
（7）αv整合素抑制剂有效阻断Runx2过表达加剧的CCl4诱导肝纤维化
（A）体外实验处理方案：针对αv整合素的抑制剂CWHM-12被用于体外实验。HBAAV-ctrl小鼠或HBAAV-Runx2小鼠接受CWHM-12（剂量为100mg/kg/天）或安慰剂（载体）处理1周，随后分离出原代HSC进行进一步研究。
（B-C）原代HSC分析：利用Western blot和qRT-PCR技术，我们检测了原发性HSC中α-SMA的蛋白质和mRNA表达水平，以评估CWHM-12对HSC活化的影响（样本数=3）。
（D）体内实验处理方案：在体内实验中，小鼠首先接受2周的CCl4处理，然后植入含有CWHM-12（剂量为100mg/kg/天）或安慰剂（载体）的Alzet微型泵，并继续接受2周的CCl4处理。
（E-F）肝脏组织分析：通过qRT-PCR和Western blot分析，我们检测了接受或未接受CWHM-12处理的HBAAV-Runx2或HBAAV-ctrl小鼠肝脏组织中α-SMA的mRNA和蛋白表达水平，以评估CWHM-12在体内对肝纤维化的影响（样本数=3）。
（G）组织染色分析：我们展示了I型胶原和α-SMA的Masson染色和免疫组化（IHC）染色的代表性显微图像，以直观地展示CWHM-12对肝纤维化程度的改善效果。比例尺：100μm（样本数=5）。
（8）PKA调控Runx2活化及其在HSC中的核转位
（A）Western blot分析：我们检测了经或未经TGF-β1（5 ng/mL）、PDGF-BB（5 ng/mL）、EGF（5 mg/mL）处理，并随后用DMSO或PKA抑制剂（PKI-6-22，10 nM/mL）处理12小时的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型胶原和Itgav的蛋白表达水平。这一实验旨在探究生长因子和PKA抑制剂对HSC活化标志物的影响（样本数=3）。
（B）细胞质与细胞核Runx2分析：我们进一步分析了经或未经TGF-β1处理，并随后用PKA活化剂（8-Bromo-cAMP，0.5 nM/mL）或抑制剂处理的原代HSC中，Runx2在细胞质和细胞核内的分布。这一实验通过Western blot技术实现，旨在揭示PKA对Runx2核转位的调控作用（样本数=3）。
（C）免疫荧光染色分析：为了直观地展示PKA抑制剂或活化剂对Runx2和α-SMA表达及定位的影响，我们对处理后的原代HSC进行了免疫荧光染色。这一实验提供了关于PKA调控HSC活化标志物表达和分布的直观证据（样本数=3）。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb | 12556S | 100ul |
| RUNX2 (D1H7) Rabbit mAb | 8486S | 100ul |
| RUNX2 (27-K) | sc-101145 | 50ug/0.5ml |
| RUNX2 (C-12) | sc-390715 | 200ug/ml |
