利用FACS技术加速酶定向进化的探索

FACS

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）作为一种在生物学、医学及药物研发领域广泛应用的关键技术，凭借其快速、高通量的分析能力，能够高效地分析溶液中的单个细胞，并同时获取多个参数信息。近年来，FCM与其他技术如质谱、显微成像等的结合，催生了多种功能强大的组合技术。其中，荧光激活细胞分选术（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）便是基于FCM原理发展而来的一种技术，它能够实现荧光标记单细胞的高效分选。

在酶催化活性和热稳定性的优化过程中，定向进化是一种常用的方法，它利用易错PCR等技术大幅提升目标酶基因的多样性。然而，传统的微孔板筛选方法成本高、耗时长，因此，高通量筛选方法在酶的定向进化中显得尤为重要。FACS技术凭借其高通量、低成本、低误差和高精度的优势，近年来在大型突变文库的筛选中得到了广泛应用。其筛选速度从传统方法的每秒一个样本提升至每秒上万个样本，且在筛选过程中所需的培养基消耗量极低，相较于传统方法几乎可以忽略不计。此外，FACS还能有效减少人工干预带来的误差，其荧光检测精度也远高于传统的酶标仪检测。

《生物技术通报》在线发表了题为《FACS技术在酶定向进化中的应用》的文章。该文章首先回顾了FCM的发展历程和基本原理，并简要介绍了基于FACS技术的流式细胞分选仪。随后，文章深入探讨了FACS在酶定向进化中的应用现状及其存在的局限性，并对FACS在该领域的发展方向和前景进行了展望。

主体结构涵盖以下几个核心部分：

1. 流式细胞术（FCM）与荧光激活细胞分选术（FACS）

   • 1.1 FCM的发展及应用概述
     此部分将介绍FCM的起源、发展历程以及其在生物学、医学和药物研发等多个领域的广泛应用。
   • 1.2 FACS的原理及仪器介绍
     此部分将详细阐述FACS的基本原理，包括其如何基于流式细胞术实现细胞分选，并介绍相关的流式细胞分选仪器及其组成部分。

2. 酶定向进化技术
   该部分将概述酶定向进化的基本概念、原理及其在改善酶催化活性和热稳定性方面的应用。

3. FACS在非分泌酶定向进化中的应用

   • 3.1 荧光标记底物筛选细胞表面酶
     介绍如何利用荧光标记的底物来筛选表达在细胞表面的酶，通过FACS实现高通量筛选。
   • 3.2 荧光标记底物筛选胞内酶
     探讨在细胞内部酶筛选中，如何运用荧光标记底物结合FACS进行高效筛选的方法。
   • 3.3 生物传感器筛选胞内酶
     介绍生物传感器技术在胞内酶筛选中的应用，特别是与FACS结合使用的策略。

4. FACS在分泌酶定向进化中的应用

   • 4.1 双乳化液滴法
     详细讨论双乳化液滴法在分泌酶筛选中的应用，包括其原理、优势以及可能遇到的问题。
   • 4.2 水凝胶微珠法
     介绍水凝胶微珠法在分泌酶高通量筛选中的使用，以及该方法如何与FACS相结合，提高筛选效率。

5. 结论与展望
   总结FACS在酶定向进化领域的应用现状，分析当前面临的挑战，并对未来的发展方向和前景进行展望。

近年来，随着荧光标记、生物传感器及液滴微流控技术的飞速进步，酶基因型与荧光表型的偶联需求得到了极大满足，进而推动了荧光激活细胞分选术（FACS）在酶定向进化领域的广泛应用。历经数十年的发展，FACS的荧光信号表型筛选能力已从单色荧光检测跃升至多色荧光同步检测，筛选通量更是突破至每秒上万次以上。本文开篇简要回顾了FACS的基本理论框架、流式细胞分选仪的构成及其工作原理，随后深入探讨了FACS在高效筛选各类酶突变体方面的应用策略及面临的挑战。本文旨在为酶定向进化领域的高通量筛选方法构建提供有益参考，以期加速酶的优化进程。

尽管FACS在加速酶定向进化、筛选优势突变酶方面展现出显著优势，但现有方法仍面临一些挑战。例如，双乳化液滴和水凝胶微珠技术存在液滴合并风险，且制备工艺复杂；液滴微流控技术直接生成含DNA或RNA文库的液滴时，可能导致文库遗传信息多样性的降低。此外，基因型与荧光表型的偶联方法亦存在局限性，如底物荧光标记法或生物传感器无法覆盖所有酶类，因此亟需开发非荧光依赖的高通量筛选技术。当前，液滴微流控领域已开发出吸光度激活液滴分选技术（AADS），该技术通过检测吸光度实现细胞分选，相关研究已证实其在酶定向进化中的实用价值，尽管其筛选通量仅为每秒千余个液滴，但成功摆脱了荧光信号的束缚。未来，将AADS与FACS技术融合，有望提升AADS的分选效率，同时使FACS技术不再受限于荧光信号，从而进一步拓宽其应用范围。

对于结构和机理未知的酶，定向进化通常依赖于随机突变构建大型突变文库，其规模可达20N（N为蛋白质一级序列长度）级别。对于此类巨型文库，FACS筛选同样耗时费力。近年来，机器学习、深度学习等人工智能技术被引入酶定向进化领域，能够快速定位未知结构和机理酶的合理突变序列空间，实现酶的理性设计，从而减小突变文库规模，构建小而精的突变文库。将人工智能与FACS技术结合，可降低FACS对巨型文库筛选的难度，同时提高FACS从小而精突变文库中筛选优势酶突变体的速度和准确性。新技术的发展及跨领域技术的融合，为FACS在酶定向进化中的应用开辟了更多可能性，并赋予了其更大的潜力。随着这些技术的持续进步和优化，我们有望见证更高效、更精确的高通量筛选方法的诞生。