贴壁细胞脂质体转染实验指南：利用无血清培养基OPTI-MEM

培养基OPTI-MEM

一、实验概述

本文旨在总结利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞（如CHO细胞）脂质体转染的实验步骤、个人经验以及常见问题分析。通过遵循本指南，实验者可以更有效地进行脂质体转染，提高转染效率和细胞存活率。

二、实验材料

1. 宿主细胞：CHO（贴壁细胞）
2. 脂质体：LIPOFECTAMINE 2000（Invitrogen公司）
3. 细胞培养板：6孔细胞培养板
4. 无血清培养基：OPTI-MEM（GIBCO）
5. 转染级质粒

三、实验步骤

1. 细胞接种：转染前一天，以适当的细胞密度（如3_{4×10^5/ml）接种到6孔培养板上。转染时，细胞应达到90}95%的融合。

2. 制备溶液：

   • 溶液1：240μl OPTI-MEM + 10μl LIPOFECTAMINE 2000（总体积250μl），温育5分钟。
   • 溶液2：Xμl OPTI-MEM + 4μg 质粒（总体积250μl）。

3. 混合溶液：将溶液1与溶液2混合，室温下静置20分钟。

4. 细胞准备：将6孔板中的细胞用OPTI-MEM冲洗两遍后，加入2ml OPTI-MEM。

5. 加入转染复合物：将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板轻轻混匀。在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。

6. 更换培养基：6小时后，更换含有血清的全培养基，继续在37℃，5%的CO2中培养48~72小时以检测转染水平。

7. 稳定转染（可选）：如需进行稳定转染，换全培养基培养后24小时，以1：10或更高的稀释比例接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

四、个人经验分享

1. 细胞状态：确保细胞处于最佳生长状态，避免使用传代过多的细胞。
2. 细胞融合度：细胞融合度需达到90%以上以确保转染效果。
3. 无血清培养基选择：OPTI-MEM优于PBS或无血清的DMEM，可提高转染效率。
4. 转染质粒质量：确保质粒纯度高、浓度高、无内毒素。
5. 转染时间：无血清培养基培养时间不宜过长，以避免对细胞产生毒性。

五、常见问题分析及解决方案

1. 细胞死亡：
   • 可能原因：细胞对OPTI-MEM敏感或细胞状态不佳。
   • 解决方案：尝试使用其他无血清培养基或调整细胞状态。
2. 转染效率下降：
   • 可能原因：细胞接种后培养时间过长，导致细胞对转染不敏感。
   • 解决方案：确保细胞在接种后24小时左右进行转染，以保证细胞处于对数生长期。
3. 转染试剂毒性：
   • 可能原因：LIPOFECTAMINE 2000毒性较高。
   • 解决方案：考虑更换其他转染试剂或调整转染条件。

六、经验推荐

• OPTI-MEM相较于PBS和无血清的DMEM培养基，具有更高的转染效率。
• 在制备转染复合物时，使用无血清培养基OPTI-MEM可提高转染效率。
• 转染后应及时更换含有血清的全培养基，以避免无血清培养基对细胞产生毒性。

遵循本指南中的实验步骤和建议，实验者可以更有效地进行贴壁细胞的脂质体转染，提高转染效率和细胞存活率。