Lipofectamine™ 2000

Lipo2000试剂的应用范围相当广泛，不仅适用于质粒DNA转染、siRNA表达载体、双链核糖核酸（dsRNA）转染，以及RNA等核酸的转染，还被广泛应用于文库筛选中的高通量转染。对于细胞转染而言，Lipo2000几乎能够覆盖包括HEK293、CHO细胞、HeLa等在内的190多种细胞系。

（一）细胞转染前的预备工作

由于转染效率与细胞培养密度密切相关，且Lipo2000脂质体转染试剂具有一定的细胞毒性，因此在使用时需确保细胞处于高密度状态。建议根据细胞的生长速度提前进行种板，并使用不含抗生素的培养基进行培养，以确保在转染时细胞处于对数生长期并达到80%-90%的汇合度。这样做有助于获得最高的转染效率和表达水平，同时尽可能减少高转染活性对细胞生长的不利影响。（可以通过预实验来观察细胞对试剂毒性的耐受程度，并据此调整细胞密度。）

（二）DNA的准备

内毒素是影响转染效率的一个重要因素。因此，在提取质粒时，必须使用无内毒素的试剂盒，以获得高纯度的DNA。随后，使用紫外可见光光度法测定DNA的浓度，并进行标记和计算所需用量。质粒的纯度可以通过A260/A280比值来衡量，理想的比值应在1.7-1.9之间，越接近1.8越好。

（三）转染复合物的制备

血清会干扰复合物的形成，进而影响转染效率。因此，在制备转染复合物时，应使用无血清培养基（如Opti-MEM）来稀释DNA和转染试剂。对于大多数细胞系而言，DNA和Lipo2000的比例通常推荐为1:2至1:3。具体的建议比例可参见下表。

对于每个转染样品（以六孔板作为示例），按照以下步骤制备转染复合物：

1. 制备Lipo2000稀释液：取一个合适的EP管，加入1500微升（每孔250微升）的Opti-MEM培养基。随后，向该管中加入60微升（每孔10微升）的Lipo2000试剂，并轻轻混匀。将混合物在室温下静置5分钟，以允许Lipo2000试剂充分分散。

2. 制备DNA稀释液：根据所使用DNA的种类，分别在另一个EP管中加入250微升/孔的Opti-MEM培养基。然后，向每个管中加入4微克/孔的质粒DNA，并轻柔地混匀，以避免DNA链的断裂。

3. 混合形成转染复合物：将步骤1)中制备的Lipo2000稀释液以250微升/孔的量加入到步骤2)中的各个DNA稀释液中。轻柔地混匀这些混合物，并在室温下静置30分钟，以允许DNA与Lipo2000试剂充分结合形成稳定的转染复合物。

(四) 执行转染操作：

在转染前大约1小时，将细胞培养基更换为新的无双抗、无血清的培养基。然后，将制备好的DNA-Lipo2000复合物分别加入到细胞培养基中。轻轻摇动培养板，以确保复合物在培养基中均匀分布。之后，将培养板放入37℃、5% CO2的培养箱中培养24-48小时。在转染后4-6小时，可以更换为完全培养基，以支持细胞的进一步生长和表达。

(五) 观察转染效果

如果转染的是带有荧光标签的质粒，可以在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达情况，从而评估转染效率。

(六) 注意事项

1. Lipo2000脂质体转染试剂应保存在4℃条件下，并避免冷冻，以防止其结构和功能受损。

2. 在使用过程中，应尽量避免Lipo2000脂质体转染试剂长时间暴露在空气中，以防止其氧化并影响转染效率。

3. 某些无血清培养基（如DMEM、CD293、SFMII、V-SFM等）可能会降低DNA和转染试剂的转染效率。因此，在选择培养基时应谨慎考虑。

4. 在处理Lipo2000脂质体转染试剂时，应避免涡旋、离心或暴力吹打等操作，而应通过缓慢晃动来混匀试剂。

5. 本指南中提供的用量仅供参考。具体用量可能需要根据细胞类型、铺板密度以及其他实验条件进行优化和调整。