一文速览：ELISA检测入门指南

ELISA测试简介

ELISA（酶联免疫吸附试验）检测是一种广泛应用于生物学和医学领域的免疫检测方法，其主要目的是测量生物样品中的抗体或抗原含量，这些目标物质可以是蛋白质、糖蛋白等。与其他免疫检测法相似，ELISA测试依赖于抗体与目标物质之间的特异性结合来实现检测目的。

ELISA检测通常在96孔板等微孔板中进行，这种格式使得该方法能够同时处理并筛选多个样品，从而提高了检测效率。血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液以及尿液等多种类型的液体样品均可用于ELISA检测，但需要注意的是，某些样品中可能存在的抑制性因素，如与目标物质共享相似抗原表位的缓冲液成分或可能破坏目标或检测成分的蛋白酶等，可能会对检测性能产生干扰。

尽管存在多种不同的ELISA检测形式，但它们都遵循一个共同的基本原理：利用目标物质本身或能够特异性捕获目标的抗体/抗原与包被在微孔板表面的物质进行结合。随后，通过一系列测定步骤，包括结合抗原（或更常见的抗体），来检测和量化这种成功的结合，其中最常见的是通过比色测定来实现。

ELISA测试的类型与示意图概述

ELISA（酶联免疫吸附试验）测试，最初由瑞典斯德哥尔摩大学的Eva Engvall和Peter Perlman以及荷兰的Anton Schuurs和Bauke van Weemen独立构思，旨在提供一种安全、有效的免疫检测方法，以替代具有潜在危险的放射免疫检测。他们通过设计基于酶的替代品，实现了这一目标。

目前，ELISA测试主要分为四种主要类型：直接法、间接法、夹心法和竞争法。

各类型ELISA简述：

直接法ELISA：
- 在此方法中，抗原直接包被在微孔板上，随后加入酶标抗体与抗原结合。通过洗涤去除未结合的酶标抗体后，加入底物进行显色反应，从而测定抗原的存在。
间接法ELISA：
- 间接法中，抗原同样包被在微孔板上，但随后加入的是未标记的一级抗体（针对抗原的特异性抗体）。洗涤后，再加入酶标二级抗体（针对一级抗体的抗体）进行结合。最后，通过底物显色反应来测定抗原。
夹心法ELISA：
- 夹心法适用于测定大分子抗原，如蛋白质。在此方法中，两种特异性抗体分别包被在微孔板的两个不同区域或同时包被。加入样品后，抗原与两种抗体结合形成“夹心”。随后加入酶标抗体（针对其中一种抗体的抗体）进行结合，并通过底物显色反应来测定抗原。
竞争法ELISA：
- 竞争法中，包被在微孔板上的可以是抗原或抗体。加入样品（含有未知浓度的抗原或抗体）和酶标抗原或抗体后，它们将竞争性地与包被物结合。通过洗涤和底物显色反应，可以测定样品中抗原或抗体的浓度。

需要注意的是，虽然上述描述以抗原测定为例，但同样的原理也适用于抗体的测定，只需调整抗原和抗体的角色即可。此外，ELISA测试的具体步骤和条件可能因实验设计和目标物质的不同而有所差异。

2.1 ELISA直接法

在ELISA直接法中，样品中的抗原或抗体首先以非特异性的方式直接吸附到包被板上。随后，向孔中加入特异性测定抗体或抗原以进行结合。之后，通过加入测定底物来产生可测量的颜色变化，这一变化可以在读板器上进行量化。

由于直接法步骤相对简洁，操作速度快，且相较于其他ELISA方法，引入错误的机会更少，因此具有一定的优势。然而，由于吸附步骤的非特异性，这种方法往往伴随着较高的背景噪音。此外，没有二级抗体步骤意味着信号没有得到放大，从而降低了检测的灵敏度。另外，直接法还需要为每个所需的目标物质创建共轭测定抗体/抗原，这增加了实验的准备成本。

2.2 ELISA间接法（iELISA）

ELISA间接法，也称为iELISA，最初于1978年开发，用于检测人血清白蛋白。其工作原理与直接法非常相似，但增加了一个二级抗体步骤，这一步骤使得测试信号得到显著放大，从而克服了直接法灵敏度不足的局限性。

间接法的另一个优势是，它不需要为每个目标物质创建特异性的共轭测定抗体/抗原。相反，共轭的二级抗体只需要对一级抗体具有物种特异性即可。这降低了实验准备的复杂性和成本。

当间接法用于检测样品中的抗体时，通常会将纯化的目标抗原涂在板上，而一级抗体则来自样品。这种设置大大减少了背景噪音，使得间接法在确定样品中的抗体滴度时成为最受欢迎的方法之一。

然而，间接法也存在一些缺点。由于步骤相对较多，方案时间较长，因此有更多出错的机会。此外，还可能存在与二级抗体产生交叉反应的风险，这需要在实验设计和数据分析时予以考虑。

2.3 ELISA夹心法

ELISA夹心法，如其名所示，是将抗原夹在两层抗体之间的一种检测技术。该技术自1977年开发以来，已经得到了广泛的应用，并可以采用ELISA直接法或间接法的形式进行（此处描述的夹心法更倾向于基于间接法的形式）。与传统的直接法或间接法不同，夹心法中的抗原与检测板的结合不再是非特异性的，而是通过捕获抗体实现特异性结合，这一改进进一步提高了检测的灵敏度和特异性。

然而，夹心法确实需要找到兼容的捕获抗体和测定抗体对，才能确保检测的有效性。同时，由于可能存在交叉反应的问题，实验设计时需要特别注意。此外，夹心法通常包含最多的步骤，因此提供了更大的出错机会。但值得注意的是，由于抗原结合步骤的高度选择性，夹心法在检测复杂混合物中的抗原时特别有用，因为此时无需对抗原进行纯化。

2.4 ELISA竞争法

ELISA竞争法，也被称为ELISA抑制法或ELISA阻断法，是ELISA技术中最为复杂的一种。该技术最初于1976年为了检测人类绒毛膜促性腺激素而开发，其工作原理是通过检测样品对预期输出信号水平的干扰，来建立一个反比关系。即样品中目标物的含量越多，测定的输出信号就越低。

除了最初的应用外，其他ELISA方法也可以被改造为竞争法的形式。竞争法的一般原则包括：样品中的抗原或抗体与参照物竞争，分别与有限数量的标记抗体或抗原结合；或者样品中的抗原或抗体与标记参照物竞争，分别与有限数量的抗体或抗原结合。

ELISA竞争法具有其独特的优点和缺点，这些特点与其采用的具体形式密切相关。然而，当抗原较小，限制了两个抗体同时结合的能力（如夹心法所要求的），或者只有一个抗体可用时，竞争法的优势就凸显了出来。在这些情况下，竞争法提供了一种有效的替代方案，用于检测样品中的目标物质。

3、ELISA检测步骤

尽管不同类型的ELISA方案存在差异，但大多数检测都包含一些共同的阶段，这些阶段对于确保检测的准确性和可靠性至关重要。

3.1 板包被

ELISA检测的第一步通常是将检测的第一个成分（如抗原、抗体或捕获抗体）与包被板结合。这一过程通常是通过被动吸附完成的，它是一个非特异性的过程，因此结果将受到涂在包被板上的物质的影响。

如果使用的是含有多种抗原的复杂样品，那么需要一个具有选择性的包被板来确保只有感兴趣的抗原被结合。然而，在如ELISA间接法用于抗体检测时使用的纯化抗原，或ELISA夹心法中使用的捕获抗体等情况下，包被板已经具有了选择性。

包被板大多由聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物制成，这些材料具有不同的结合特性，取决于目标物质和检测的性质。对于某些难以吸附的目标物质，如重度糖基化的蛋白质、碳水化合物、DNA、脂类、短肽以及含有洗涤剂的蛋白质，建议使用经过特殊处理允许共价连接到表面的包被板。

3.2 孵育

将试剂加入ELISA板后，必须进行孵育以便有足够的时间进行结合或反应。孵育的温度和时间将取决于具体的检测步骤和正在进行的操作。通常在样品应用之后，会在37℃下孵育1小时。然而，某些步骤（如阻断）可以在冰箱中过夜进行，而测定过程中的孵育则通常在室温下进行，且时间要短得多。

3.3 洗涤

洗涤是在检测每个组成部分应用之间直至结果测定前的一个重要步骤。在溶液从孔中排空后，通常使用磷酸盐缓冲盐水-吐温20（PBST）作为缓冲液来清洗孔，以去除任何残留的未结合抗原、抗体或试剂。

洗涤可以手工使用多通道移液器完成，也可以使用自动洗板机进行。不充分的洗涤可能会导致高背景信号，而过度的洗涤则可能导致样品信号降低。洗涤的不一致性可能会导致整个板块的结果不一致，从而影响结果的可靠性。

3.4 阻断

在用蛋白质包被ELISA板后，阻断通常是必要的。阻断的目的是防止在接下来方案步骤中测定抗体的任何非特异性结合。通过封闭包被板上未结合的位点，可以减少非特异性结合的发生，从而提高检测的特异性和准确性。

3.5 阻断

为了占据任何可用的非特异性结合位点，与检测无关的混合蛋白被添加到板中并进行孵育。这些蛋白质作为阻断剂，能够减少非特异性结合的发生，从而提高检测的特异性和准确性。常见的蛋白质阻断缓冲液选择包括脱脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。这些蛋白质通过与包被板上未结合的位点结合，形成一层保护层，防止测定抗体在后续步骤中的非特异性结合。

另外，非离子洗涤剂如Tween 20或Triton X-100也可以作为阻断剂使用，但它们不能像蛋白质那样提供永久性的阻断效果。如果板块阻断无效，会导致背景噪音增加，从而降低检测的灵敏度和特异性。

3.6 抗体

实验性抗体是大多数ELISA检测的核心组成部分，选择正确的抗体至关重要。单克隆抗体和多克隆抗体都可以用于ELISA检测，它们各自具有独特的优点和缺点。单克隆抗体提供高特异性，能够精确地识别目标抗原的特定表位，但成本相对较高。另一方面，多克隆抗体可以在多个结合点与目标抗原结合，从而放大信号并提高检测的灵敏度。

在使用二级抗体的方法中，虽然增加了额外的步骤和检测时间，并增加了出错的机会，但多克隆二级抗体所带来的灵敏度提高可能使其成为一种值得考虑或必须的有效检测方法。因此，在选择抗体时，需要根据具体的检测需求和目标抗原的特性来权衡单克隆抗体和多克隆抗体的优缺点。

3.7 测定

无论使用哪种类型的ELISA检测，最后一步都是测定步骤。最常见的是利用酶介导的可见颜色变化化学反应来进行测定。酶结合抗原或抗体被应用到测试孔中，如果目标抗原或抗体存在，它就会与之结合。当加入适当的酶底物时，酶会催化底物发生颜色变化，这种颜色变化与孔内结合的目标物的数量成正比。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种常用的酶共轭物，它通常与底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）一起使用。在HRP的作用下，TMB会变成蓝色，然后在加入硫酸溶液后变成黄色，从而停止反应。这种颜色变化可以通过酶标仪（一种紫外可见分光光度计）来测定每个孔的吸光度值。根据检测设计，可以对这些吸光度值进行校正和计算，如减去空白孔的平均值、技术重复的平均值或与标准品的比率进行计算，以得出最终的检测结果。

4、解读ELISA测试结果

ELISA检测结果可以以定量、定性或半定量的方式进行解释。

在定量检测中，通过使用已知标准的连续稀释液来生成一条标准曲线，该曲线通常表示光密度（OD）与浓度的关系。利用这条标准曲线，可以精确地计算出未知样品中目标物的数量。这种方法提供了关于目标物浓度的具体数值信息。

在定性检测中，虽然同样使用酶标仪来收集数据，但结果的解释并不依赖于标准曲线。相反，通过与空白孔和/或阴性孔的比较，将结果解释为阳性或阴性。这种方法提供了关于目标物是否存在的直接信息。

半定量检测则介于定量和定性之间。在不使用连续稀释或标准曲线的情况下收集数据，但包含阴性和阳性标准（通常是高阳性和低阳性），以便对未知样本井和已知状态的样本孔之间的水平进行相对比较。通过设定临界值，可以将结果分为阳性或阴性，并可能包括一个“灰区”，对于落在该区域内的样品，建议重新测试或进一步调查。

虽然定量检测在某些情况下可能更为准确和有用，但每块板上包含一条完整的标准曲线会占用宝贵的孔位资源。因此，在选择检测方法时，需要根据用户希望从检测结果中获得的信息类型进行权衡。

值得注意的是，ELISA检测结果很少能达到100%的准确性，假阳性和假阴性结果都是可能发生的。因此，大多数ELISA测试都会与灵敏度和特异性相关联，这两个指标越接近100%，测试的性能就越好。然而，许多因素都可能影响这些值，如非特异性结合或交叉反应导致的高背景、抗体对其目标的亲和力不足、非最佳的检测条件以及样本的条件和复杂性等。

因此，在计算灵敏度和特异性的数值时，需要仔细考虑这些因素，并采取相应的措施来优化检测方法。特别是在诊断环境中，确定获得的任何结果的信息量和可靠性是至关重要的。

5、ELISA检测的应用

自其诞生以来，ELISA检测因其灵活性和成本效益而广受欢迎，并已在多个领域找到了广泛的应用。以下是一些重点介绍的应用领域。

5.1 传染性疾病诊断

ELISA检测在传染性疾病的诊断中发挥着重要作用。它可以用于检测病原体本身，也可以检测宿主对病原体产生的抗体反应，具体取决于所选的检测方法。因此，ELISA在识别可能构成感染威胁或需要治疗的感染者，以及在流行病学监测中识别既往感染者方面非常有用。

对于某些慢性感染，特别是当病原体负荷波动时，单纯检测病原体可能难以发现感染。然而，在这些感染者中，可以检测到持续的抗体反应，即使病原体本身无法检测到，也有助于准确识别这些感染者。例如，HIV的通用测试方法就是在1985年开发的ELISA检测。此外，ELISA还可以用于诊断其他疾病，如登革热、乙型肝炎、SARS-CoV-2、马氏链球菌和大肠杆菌等。

尽管LAM ELISA检测在结核病（TB）患者尿液中的LAM测定方面具有一定的潜力，但其灵敏度和临床效用一直受到质疑。然而，科学家们正在不断努力改进这一检测方法，并尝试将其扩展到其他样本类型，如痰和血清，但目前的成效尚不显著。

5.2 食物过敏原的检测

对于食品来说，宣布不含某些过敏原至关重要，因为过敏原如果被受影响的人摄入可能是致命的。ELISA检测在此方面提供了极高的灵敏度，有时可达百万分之一（ppm）以下，并且能够应对一些难以用其他方法（如PCR）处理的食品类型，如油和奶。然而，需要注意的是，食品加工过程（如加热）可能会改变过敏原的构象，从而对ELISA测定产生负面影响。

5.3 生物仿制药和生物制药检测

随着生物仿制药的发展，有必要证明它们与参考药物之间的相似性。ELISA在此方面发挥了重要作用，用于确定药物的总浓度、检测杂质等因素。

5.4 癌症生物标志物测试

癌症生物标志物通常可以在血液样本中检测出来。因此，ELISA测试可以作为一种非侵入性的方法，用于测定和量化已知的生物标志物，为癌症的早期诊断和治疗提供重要信息。

5.5 法医药物检测

ELISA检测在法医领域也有广泛应用。毒理学家可以使用ELISA筛选法医样品中的滥用药物痕迹，包括安非他命、可卡因、鸦片制剂、美沙酮、苯并二氮杂卓和大麻素等。虽然液体样品（如尿液或血液）比较容易处理，但也可以对固体样品（如头发）进行ELISA分析。

5.6 怀孕测试

人绒毛膜促性腺激素（hCG）是怀孕时产生的一种激素。通过ELISA检测尿液样品中的hCG水平，可以判断女性是否怀孕。

5.7 自身免疫性疾病

指示自身免疫性疾病的标志物，如类风湿性关节炎和红斑狼疮等，可以通过ELISA进行测定和定量。这有助于医生诊断疾病、评估病情严重程度以及制定治疗方案。

名称	货号	规格
人IL-6 ELISA检测服务	bulk-elisa-hIL-6-EA	EA
大鼠IL-6 ELISA检测服务	bulk-elisa-rIL-6-EA	EA
大鼠IFN-gamma ELISA检测服务	bulk-elisa-rIFN-gamma-EA	EA
大鼠TGF-beta1 ELISA检测服务	bulk-elisa-rTGF-beta1-EA	EA