全面探索：荧光染料的多彩世界与广泛应用

荧光染料

荧光染料是一种能够标记蛋白质、核酸、聚糖等生物结构以及钙离子等非生物物质的染色剂。通过与相应的抗体或抗原发生特异性结合，荧光染料可以实现对目标物质的定位、定性和定量分析。这种方法因其高度的特异性、敏感性和直观性，成为了早期免疫标记技术的重要组成部分。

免疫荧光 (IF)

在荧光显微镜技术中，观察目标蛋白有两种主要方法：一是利用内源荧光信号，即通过基因工程手段将荧光蛋白与目标蛋白融合表达；二是利用特异性荧光标记的抗体与目标蛋白结合。在某些生物学研究中，第二种方法可能更为适用或必要。例如，在组织学样本中，由于样本通常来源于无法保存荧光蛋白的生物体，因此无法使用荧光蛋白技术。此外，当已有功能性抗体可用时，采用免疫荧光法相较于荧光蛋白技术更为迅速，因为后者需要先克隆目标基因，再将DNA转入适当的细胞中表达。荧光蛋白的一个额外缺点是它本身也是一种蛋白质，因此，细胞内的荧光蛋白可能因其特定的蛋白质性质而导致与之融合的目标蛋白质功能异常或错误释放。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞动态的首选方法。

免疫荧光法基于抗体与相应抗原的特异性结合原理，并有两种表现形式。最直接的方式是使用已标记有荧光染料的抗体直接与目标蛋白结合，这种方法被称为“直接免疫荧光法”。

在许多情况下，我们可以利用两种具有不同特性的抗体来进行免疫荧光实验。第一种抗体（一抗）能够特异性地结合目标蛋白，但它本身并不携带荧光标记。第二种抗体（二抗）则携带荧光染料，并能特异性地结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”，它具有多重优势。首先，它实现了信号的放大，因为多个二抗可以结合到同一个一抗上。其次，这种方法无需为每个针对目标蛋白的抗体都进行荧光标记，而是可以使用市场上已有的荧光标记二抗，从而提高了实验的灵活性和效率。

FITC 和 TRITC

异硫氰酸荧光素（FITC）是一种有机荧光染料，至今仍广泛应用于免疫荧光和流式细胞术领域。该染料在495/517纳米处展现出激发/发射峰值，通过其异硫氰酸盐反应基团，能够与抗体上的氨基、巯基、咪唑基、酪氨酰基、羰基等多种基团结合。荧光素作为FITC的基本成分，其摩尔质量为332克/摩尔，常作为荧光示踪剂使用。FITC（摩尔质量为389克/摩尔）是荧光显微镜技术中首批应用的染料之一，被视为后续如Alexa Fluor®488等先进荧光染料的先驱。FITC的荧光活性源自其大共轭芳香电子系统，该系统在蓝色光谱光的激发下产生荧光。

常与FITC搭配使用的另一种染料是结构相似的TRITC（四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸）。与FITC不同，TRITC不属于荧光素类别，而是罗丹明家族的一员。罗丹明同样拥有一个引发荧光行为的大共轭芳香电子系统。此外，TRITC（摩尔质量为479克/摩尔）的激发最大波长为550纳米，位于绿色光谱区域，其发射最大波长为573纳米，与FITC形成对比。TRITC与蛋白质（如抗体）的结合也是基于异硫氰酸盐反应基团实现的。

青色素

青色素类荧光染料是一个相对较小的类别，它们的名称均源自青色素，并从这种基础染料衍生而来。这类染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7等。所有这些青色素染料都可以通过特定的反应基团与核酸或蛋白质进行连接，例如，使用带有马来酰亚胺基团的蛋白质标记方法。值得注意的是，Cy5染料的荧光特性对其周围的电子环境极为敏感，这一特性使得Cy5在酶测定中具有独特的应用价值。当与之结合的蛋白质构象发生变化时，Cy5的荧光发射会相应地产生正向或负向的变化。此外，Cy3和Cy5还被广泛应用于荧光共振能量转移（FRET）实验中。尽管青色素染料属于较早期的荧光染料，但它们在亮度、耐光性以及量子产率等方面为后续荧光染料的改进提供了重要的基础。

Alexa Fluor®染料

Alexa Fluor®染料是一系列带负电荷且亲水的荧光染料，广泛应用于荧光显微镜技术中。这一系列染料的命名源自其发明者Richard Paul Haugland，以纪念他的儿子Alex Haugland。Alexa Fluor®是Molecular Probes（现为美国Thermo Fisher旗下Life Technologies公司的子公司，自2014年2月起归属该公司）的注册商标，同时，产品标识中也包含了相应的激光激发波长信息。

例如，Alexa Fluor®488是一种应用广泛且性能卓越的染料，其最大激发波长为493纳米，可由标准的488纳米激光激发。Alexa Fluor®488的最大发射波长为519纳米，这些特性使得它与异硫氰酸荧光素（FITC）具有相似的属性。尽管Alexa Fluor®488是荧光素的一种衍生物，但与FITC相比，它展现出更佳的稳定性和荧光亮度，同时pH敏感度也相对较低。

整个Alexa Fluor®染料系列（包括Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633等）都是由不同基础荧光物质经过磺化处理得到的，这些基础物质包括荧光素、香豆素、青色素或罗丹明等。这些染料的摩尔质量范围在410至1400克/摩尔之间，为科研人员提供了多样化的选择，以满足不同实验需求。

DNA 染色

在荧光显微镜技术中，核酸的研究价值与蛋白结构同样重要。为了精确定位细胞并确定其数量，对细胞核进行DNA染色是不可或缺的步骤。DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）是最为常用的DNA染色剂之一，它能特异性地结合DNA双螺旋中的A-T富集区域。当DAPI与DNA结合后，其荧光强度显著增强。DAPI的最大激发波长为358纳米，紫外光激发下，其发射光谱宽泛，并在461纳米处达到峰值。此外，DAPI还能与RNA结合，尽管荧光较弱，此时发射波长会移至500纳米。值得注意的是，DAPI具有良好的细胞膜穿透性，因此适用于固定细胞和活细胞的染色。

另一类广泛应用的DNA染色剂是Hoechst染料系列，这些染料最初由Hoechst AG化学公司生产。Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580均属于双苯酰亚胺类染料，它们能够嵌入A-T富集区域。与DAPI类似，这些染料在最大发射波长为455纳米的紫外光激发下发光，未结合的染料发射波长则在510–540纳米之间。Hoechst染料同样具有细胞渗透性，适用于活细胞和固定细胞的染色，且相较于DAPI，其毒性较低。

碘化丙啶（PI）是一种无法穿透细胞膜的DNA染色剂，因此常用于区分活细胞和死细胞。PI作为嵌入剂，对碱基无选择性结合。与核酸结合后，PI的最大激发波长为538纳米，最大发射波长为617纳米。未结合的PI激发和发射波长及光强均较低。此外，PI还能与RNA结合，且荧光特性不变。为了区分DNA和RNA，有时需要使用适当的核酸酶处理。

吖啶橙则无需预处理即可鉴别DNA与RNA。与DNA结合时，吖啶橙的最大激发/发射波长为502纳米/525纳米；而与RNA结合时，则为460纳米/650纳米。此外，吖啶橙还能进入溶酶体等酸性细胞器，在酸性环境下被质子化，由蓝色光谱光激发，发射波长在橙色区域达到最大。由于凋亡细胞含有大量被吞噬的酸性细胞器，吖啶橙常被用作凋亡细胞的标记物。

离子成像

在神经元研究领域中，观察基因活性、细胞运动等现象对于理解细胞内离子浓度的变化至关重要。钠、钙、氯、镁等离子对众多细胞活动具有显著影响。为了研究这些离子，科学家们通常使用荧光标记的螯合剂来捕获离子，这些螯合剂在结合特定离子后会改变其光谱特性，从而成为离子成像的有效工具。

例如，在钙离子检测方面，常用的钙指示剂包括fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green等。这些指示剂通过与钙离子结合，能够发出特定波长的荧光，从而反映细胞内钙离子的浓度变化。对于钠离子的检测，SBFI（sodium-binding benzofurzanisophthalate）和Sodium Green是两种常用的荧光指示剂。它们通过与钠离子结合，改变自身的荧光特性，从而实现对钠离子浓度的监测。

同样地，PBFI（potassium-binding benzofurzanisophthalate）则被用于钾离子的检测。这种指示剂能够特异性地结合钾离子，并通过荧光信号的变化来反映钾离子的浓度。

此外，还有一种以蛋白质为基础的钙指示剂，其中最具代表性的是基于水母化学发光蛋白——水母素开发的指示剂。水母素、发光体腔肠素、分子氧和Ca2+之间的相互作用能够释放蓝光，这一机制在荧光蛋白质的发现过程中具有重要意义。利用这一原理，科学家们开发出了能够用于实时监测细胞内钙离子浓度的荧光蛋白质探针，为神经元研究提供了强有力的工具。

名称	货号	规格
SYBR Green 1 荧光染料	abs47043115-100ul	100ul
TSA单色荧光染料480	bulk-TSA480-20T	20T
ROX 参考荧光染料	ROX-20ul	20ul
ROX 参考荧光染料	ROX-200ul	200ul