蛋白质免疫印迹 (Western Blot,WB)

蛋白质免疫印迹，又称Western Blot，是分子生物学、生物化学及免疫遗传学领域内广泛采用的一种实验技术。它的核心原理是利用特异性抗体，对经过凝胶电泳处理的细胞或生物组织样本进行标记（着色）。通过观察和分析这些标记（着色）的位置及其深浅程度，可以获取关于特定蛋白质在目标细胞或组织中表达状况的重要信息。

印迹法（blotting）是一种实验技术，涉及将样品转移到固相载体（如膜）上，随后利用特定的探测反应来检测该样品。1975年，Southern开发了一种方法，即将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交技术来检测特定的DNA片段，这种方法被称为Southern印迹法。

1977年，斯坦福大学的James Alwine、David Kemp和George Stark发明了另一种技术，他们将RNA转移到硝酸纤维素膜上，并利用RNA-DNA杂交来检测特定的RNA片段，这种方法被称为Northern印迹法。1979年，美国斯坦福大学的George Stark又发明了一种针对单向电泳后蛋白质分子的印迹分析技术，该技术被称为Western印迹法。

此外，对于经过双向电泳处理的蛋白质分子的印迹分析，人们称之为Eastern印迹法。

Western Blot的基本原理概述如下：

首先，通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术，对蛋白质样品进行分离。这一步骤的目的是将复杂的蛋白质混合物分解成单个的或多肽链的组分，并依据其分子量大小进行排列。随后，这些分离后的蛋白质被转移到固相载体上，常用的载体是硝酸纤维素膜（NC膜）。NC膜以非共价键的方式吸附蛋白质，同时保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不发生变化。

为了封闭NC膜上未与蛋白质结合的疏水位点，防止非特异性结合的发生，接下来用含有蛋白质（如5%的牛血清白蛋白BSA或脱脂奶粉溶液）的溶液对膜进行处理。

处理完毕后，使用针对所要研究的蛋白质的特异性抗体（一抗）与膜上的蛋白质进行反应。在这一步骤中，只有待研究的蛋白质能与一抗特异性结合，形成抗原-抗体复合物，而其他蛋白质则不能与一抗结合。通过清洗，可以去除未结合的一抗，此时，膜上仅留下与待研究蛋白质结合的一抗。接下来，用标记的二抗与膜上的一抗进行反应。二抗是针对一抗的抗体，它的作用是进一步放大信号，便于检测。通过形成蛋白质-一抗-二抗复合物，可以利用二抗上的标记信号（如荧光、放射性同位素等）来检测到目的蛋白。

需要注意的是，二抗与一抗的来源应该是不同的物种，以避免它们之间的非特异性结合。例如，如果一抗是从鼠中获得的，那么二抗应该是来自另一个物种（如兔、羊等）的抗鼠抗体。这样的设计可以确保检测的特异性和准确性。