透明质酸酶
摘要
透明质酸酶（Hyaluronidase）是一类能够特异性水解透明质酸（Hyaluronic acid，HA）的水解酶，广泛存在于真核生物和原核生物中。透明质酸是一种重要的生理活性物质，参与多种生物学过程，如细胞分裂、细胞间连接、生殖细胞活动、DNA转染、胚胎发育、受伤组织修复以及正常细胞和肿瘤细胞的增生。鉴于透明质酸酶在生物学和医学领域的重要性，本文旨在提供一种高纯度重组人透明质酸酶的纯化方法，并对其性质进行深入研究。
一、引言
透明质酸是一种天然多糖，具有独特的理化性质和生物学功能。它广泛存在于人体各种组织中，如皮肤、关节滑液、眼玻璃体和血管壁等。透明质酸酶则能够特异性地水解透明质酸，从而改变组织的渗透性和细胞外基质的结构。因此，透明质酸酶在药物递送、组织工程、眼科手术、癌症治疗等领域具有广泛的应用前景。
然而，天然透明质酸酶的来源有限，且可能存在免疫原性和稳定性问题。因此，利用基因工程技术生产重组透明质酸酶成为研究热点。本文将介绍一种重组人透明质酸酶的纯化方法，并对其性质进行深入研究。
二、材料与方法
- 实验材料
- 含有人透明质酸酶基因PH20/SPAMI的重组表达载体
- CHO细胞系
- 生物反应器
- 各种层析柱及缓冲液
- 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
- 质谱仪和测序仪
- 实验方法
（1）重组表达与细胞培养
将含有人透明质酸酶基因PH20/SPAMI的重组表达载体转化CHO细胞，并利用生物反应器进行培养。通过优化培养条件，提高重组人透明质酸酶的表达水平。收集细胞培养液，进行后续纯化步骤。
（2）初步纯化
使用中空纤维柱处理细胞培养液，收集透过液。将透过液用超滤膜包进行浓缩，并置换缓冲液。这一步骤可以去除大部分杂质，为后续层析纯化奠定基础。
（3）阴离子交换层析
将初步纯化的蛋白溶液上样至Q sepharose Fast Flow阴离子交换柱。先用预洗液洗涤杂蛋白，再用洗脱液等度洗脱收集洗脱峰。这一步骤可以进一步去除杂质，提高目标蛋白的纯度。
（4）Phenyl HP柱层析
使用Phenyl sepharose HP层析柱对阴离子交换层析收集的目的蛋白进行进一步纯化。通过优化洗脱条件，提高目标蛋白的回收率和纯度。
（5）CHT I型柱层析
将Phenyl HP柱层析收集的洗脱液上样至CHT I型层析柱。通过优化洗脱条件，进一步去除杂质，提高目标蛋白的纯度。
（6）阳离子交换层析
将CHT I型柱层析收集的洗脱液用样品稀释液稀释至适当电导后，上样至SP sepharose HP阳离子交换柱。通过等度洗脱，收集洗脱峰。这一步骤可以去除残留的杂质，获得高纯度的重组人透明质酸酶。
（7）超滤换液与浓缩
将阳离子交换层析收集的洗脱液进行超滤换液和浓缩，获得终浓度为1.0 mg/ml的重组人透明质酸酶溶液。
（8）比活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定重组人透明质酸酶的比活性。通过测定还原糖的生成量来间接反映酶的活性。
（9）分子量与N端测序
利用MALDI-TOF-MS质谱仪对重组人透明质酸酶的分子量进行检测。同时，使用ABI PROCISETM494仪器进行蛋白质N端测序，验证重组蛋白的序列正确性。
（10）纯度分析
利用SDS-PAGE和分子排阻Sec-HPLC方法对纯化获得的重组人透明质酸酶的纯度进行分析。
三、实验结果
- 纯化过程与结果
（1）重组表达与细胞培养
通过优化培养条件，CHO细胞成功表达了重组人透明质酸酶，表达水平达到100 mg/L。收集细胞培养液后，进行中空纤维柱处理，收集透过液。
（2）初步纯化
将透过液用超滤膜包进行浓缩和缓冲液置换后，获得了较为纯净的蛋白溶液。这一步骤去除了大部分杂质，为后续层析纯化提供了良好的基础。
（3）阴离子交换层析
通过Q sepharose Fast Flow阴离子交换柱的纯化，获得了较为单一的洗脱峰。这一步骤进一步去除了杂质，提高了目标蛋白的纯度。
（4）Phenyl HP柱层析
使用Phenyl sepharose HP层析柱对阴离子交换层析收集的目的蛋白进行进一步纯化后，获得了更为纯净的蛋白溶液。
（5）CHT I型柱层析
将Phenyl HP柱层析收集的洗脱液上样至CHT I型层析柱后，获得了高纯度的重组人透明质酸酶。
（6）阳离子交换层析
通过SP sepharose HP阳离子交换柱的纯化，进一步去除了残留的杂质，获得了纯度更高的重组人透明质酸酶。
（7）超滤换液与浓缩
将阳离子交换层析收集的洗脱液进行超滤换液和浓缩后，获得了终浓度为1.0 mg/ml的重组人透明质酸酶溶液。
- 比活性测定结果
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定重组人透明质酸酶的比活性时，发现透明质酸酶标准品溶液活性与吸光度之间在0-401 U/ml浓度范围内呈线性关系。根据线性回归方程计算得到的重组人透明质酸酶的比活性为1.0×10^5 IU/mg，表明纯化获得的重组人透明质酸酶具有较高的活性。
- 分子量与N端测序结果
利用MALDI-TOF-MS质谱仪对重组人透明质酸酶的分子量进行检测时，发现其脱糖分子量为51105 Da，与理论值相符。同时，使用ABI PROCISETM494仪器进行蛋白质N端测序时，发现重组人透明质酸酶N端的15个氨基酸序列为LEU-ASN-PHE-ARG-ALA-PRO-PRO-VAL-ILE-PRO-ASN-VAL-PRO-PHE-LEU，与理论序列完全吻合。这些结果表明纯化获得的重组人透明质酸酶具有正确的分子量和N端序列。
- 纯度分析结果
利用SDS-PAGE和分子排阻Sec-HPLC方法对纯化获得的重组人透明质酸酶的纯度进行分析时，发现其纯度分别为98.2%和98.24%。这些结果表明纯化获得的重组人透明质酸酶具有较高的纯度，满足后续研究和应用的需求。
四、讨论
本文成功地建立了一种高纯度重组人透明质酸酶的纯化方法。通过优化表达条件、选择合适的层析柱和洗脱条件以及超滤换液和浓缩步骤，我们获得了纯度高达98.2%以上的重组人透明质酸酶。同时，通过比活性测定、分子量与N端测序以及纯度分析等实验手段验证了纯化获得的重组人透明质酸酶的性质和纯度。
重组人透明质酸酶在医学和生物学领域具有广泛的应用前景。它可以作为药物递送系统的载体，提高药物的生物利用度和靶向性；也可以作为组织工程的支架材料，促进细胞的生长和分化；此外，它还可以用于眼科手术中的透明质酸去除以及癌症治疗中的肿瘤组织渗透等。因此，进一步研究和开发重组人透明质酸酶的应用具有重要意义。
然而，目前关于重组人透明质酸酶的研究仍存在一些问题和挑战。例如，如何进一步提高其表达水平和纯化效率？如何降低其免疫原性和提高其稳定性？如何更好地探索其应用领域和拓展其新功能？这些问题都需要我们进行深入的研究和探索。
五、结论
本文成功地建立了一种高纯度重组人透明质酸酶的纯化方法，并对其性质进行了深入研究。通过优化表达条件、选择合适的层析柱和洗脱条件以及超滤换液和浓缩步骤，我们获得了纯度高达98.2%以上的重组人透明质酸酶。同时，通过比活性测定、分子量与N端测序以及纯度分析等实验手段验证了纯化获得的重组人透明质酸酶的性质和纯度。这些研究成果为进一步研究和开发重组人透明质酸酶的应用提供了有力支持。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 透明质酸酶 | abs42225221-10mg | 10mg |
| 透明质酸酶（牛睾丸） | abs44063397-500mg | 500mg |
| 透明质酸酶（羊睾丸） | abs9239-100ml | 100ml |
| 免疫印迹及免疫沉淀用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂） | abs9239-100ml | 100ml |
