TGR5 agonist inhibits intestinal epithelial cell apoptosis via cAMP/PKA/c-FLIP/JNK signaling pathway and ameliorates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis

摘要

肠上皮细胞（IEC）过度凋亡是破坏上皮稳态的关键因素，从而导致溃疡性结肠炎（UC）的发病。然而，关于Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5）在IEC凋亡中的调节作用及其潜在分子机制仍不明确，同时，也缺乏TGR5选择性激动剂用于治疗UC的直接证据。本研究中，我们合成了一种强效且选择性的TGR5激动剂OM8，该激动剂在肠道中具有高分布特性，并探讨了其对IEC凋亡及UC治疗的影响。结果显示，OM8能够强效激活人源（hTGR5）和鼠源（mTGR5）TGR5，EC50值分别为202±55 nM和74±17 nM。口服给药后，OM8大量保留在肠道内，血液吸收极低。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠中，口服OM8能够缓解结肠炎症状、病理变化及紧密连接蛋白表达受损的情况。除了促进肠道干细胞（ISC）增殖和分化外，OM8给药还显著降低了结肠炎小鼠结肠上皮中凋亡细胞的比例。OM8对IEC凋亡的直接抑制作用在HT-29和Caco-2细胞的体外实验中得到了进一步验证。在HT-29细胞中，我们证明沉默TGR5、抑制腺苷酸环化酶或蛋白激酶A（PKA）均阻断了OM8诱导的JNK磷酸化抑制，从而取消了其对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导凋亡的拮抗作用，这表明OM8对IEC凋亡的抑制作用是通过激活TGR5和cAMP/PKA信号通路介导的。进一步研究表明，OM8以TGR5依赖的方式上调了HT-29细胞中细胞FLICE抑制蛋白（c-FLIP）的表达。敲低c-FLIP阻断了OM8对TNF-α诱导的JNK磷酸化和凋亡的抑制作用，这表明c-FLIP对于OM8抑制IEC凋亡是不可或缺的。综上所述，本研究揭示了TGR5激动剂通过体外cAMP/PKA/c-FLIP/JNK信号通路抑制IEC凋亡的新机制，并强调了TGR5激动剂作为UC新型治疗策略的价值。

引言

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性、复发性和炎症性肠道疾病，其特征是肠道黏膜持续炎症和溃疡形成。肠上皮细胞（IEC）作为肠道屏障的第一道防线，在维持肠道稳态和抵御病原体入侵中发挥着关键作用。IEC凋亡过度会破坏上皮屏障完整性，导致肠道炎症和UC的发生。因此，寻找能够调节IEC凋亡的靶点对于UC的治疗具有重要意义。

Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5）是一种在肠道中广泛表达的膜受体，能够响应多种代谢物（如胆汁酸和某些小分子化合物）的刺激。近年来，TGR5在调节肠道稳态、炎症和代谢中的作用逐渐受到关注。然而，关于TGR5在IEC凋亡中的具体作用及其潜在机制仍不清楚。本研究旨在合成一种强效且选择性的TGR5激动剂，并探讨其对IEC凋亡及UC治疗的影响，以期为UC的治疗提供新的策略。

材料与方法

1. OM8的合成与表征

   本研究通过化学合成方法制备了TGR5激动剂OM8，并通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等分析方法对其结构进行了表征。

2. 细胞培养与实验分组

   选用HT-29和Caco-2细胞系作为IEC的代表，进行体外实验。细胞分为对照组、OM8处理组、TNF-α诱导凋亡组及OM8+TNF-α共处理组等，以观察OM8对IEC凋亡的影响。

3. 动物实验

   选用DSS诱导的结肠炎小鼠模型进行体内实验。小鼠分为正常对照组、DSS模型组及OM8治疗组等，通过口服给药方式观察OM8对结肠炎症状、病理变化及紧密连接蛋白表达的影响。

4. 信号通路分析

   采用Western blot、qRT-PCR等方法检测TGR5、cAMP/PKA信号通路相关分子（如PKA、c-FLIP、JNK等）的表达及磷酸化水平，以探讨OM8抑制IEC凋亡的分子机制。

5. 数据分析

   采用SPSS等统计软件进行数据分析，比较各组之间的差异，并计算P值等统计指标。

结果

1. OM8的合成与表征

   成功合成了TGR5激动剂OM8，并通过NMR、MS等方法验证了其结构。OM8在肠道中具有高分布特性，且口服给药后血液吸收极低。

2. OM8对IEC凋亡的影响

   在HT-29和Caco-2细胞中，OM8能够显著抑制TNF-α诱导的IEC凋亡，降低凋亡细胞的比例。同时，OM8还能够促进IEC的增殖和分化。

3. OM8对DSS诱导的结肠炎小鼠的治疗作用

   在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，OM8能够显著缓解结肠炎症状，如体重下降、腹泻、便血等。同时，OM8还能够改善肠道病理变化，如肠道黏膜充血、水肿、溃疡等。此外，OM8还能够恢复紧密连接蛋白的表达，增强肠道屏障功能。

4. OM8抑制IEC凋亡的分子机制

   通过Western blot、qRT-PCR等方法检测发现，OM8能够激活TGR5并诱导cAMP/PKA信号通路的活化。进一步研究表明，OM8以TGR5依赖的方式上调了c-FLIP的表达。敲低c-FLIP后，OM8对TNF-α诱导的JNK磷酸化和凋亡的抑制作用被取消。这表明OM8抑制IEC凋亡的分子机制是通过激活TGR5/cAMP/PKA/c-FLIP/JNK信号通路实现的。

讨论

本研究成功合成了强效且选择性的TGR5激动剂OM8，并探讨了其对IEC凋亡及UC治疗的影响。结果表明，OM8能够显著抑制IEC凋亡并改善DSS诱导的结肠炎小鼠的症状和病理变化。进一步研究表明，OM8抑制IEC凋亡的分子机制是通过激活TGR5/cAMP/PKA/c-FLIP/JNK信号通路实现的。这一发现为UC的治疗提供了新的策略。

TGR5作为肠道中的关键受体，在调节肠道稳态和炎症中发挥着重要作用。本研究发现OM8能够激活TGR5并诱导cAMP/PKA信号通路的活化，从而抑制IEC凋亡。这一机制可能涉及多种信号分子的相互作用和调控网络。未来的研究将进一步探讨TGR5/cAMP/PKA信号通路在UC发病中的作用及其与其他信号通路的交叉互作关系。

此外，本研究还发现OM8能够上调c-FLIP的表达并抑制JNK的磷酸化。c-FLIP是一种重要的凋亡抑制蛋白，能够拮抗多种凋亡刺激诱导的细胞死亡。JNK作为一种应激激活的蛋白激酶，在细胞凋亡和炎症中发挥着重要作用。OM8通过上调c-FLIP的表达并抑制JNK的磷酸化来抑制IEC凋亡，这一机制可能涉及多种凋亡相关分子的调控和相互作用。未来的研究将进一步探讨c-FLIP和JNK在UC发病中的作用及其与TGR5/cAMP/PKA信号通路的相互关系。

结论

本研究成功合成了强效且选择性的TGR5激动剂OM8，并探讨了其对IEC凋亡及UC治疗的影响。结果表明，OM8能够显著抑制IEC凋亡并改善DSS诱导的结肠炎小鼠的症状和病理变化。进一步研究表明，OM8抑制IEC凋亡的分子机制是通过激活TGR5/cAMP/PKA/c-FLIP/JNK信号通路实现的。这一发现为UC的治疗提供了新的策略，并强调了TGR5作为潜在治疗靶点的价值。未来的研究将进一步探讨TGR5激动剂在UC治疗中的应用前景及其与其他治疗方法的联合应用效果。