免疫组织化学（IHC）
一、引言
免疫组织化学（IHC）是免疫学和传统组织化学相结合的产物，它通过抗原抗体的特异性结合，实现对组织和细胞中特定化学物质的检测和定位。IHC技术具有较高的敏感性和特异性，能够将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，为生物医学研究和临床诊断提供了有力的工具。
二、IHC的原理
IHC基于抗原与抗体之间的特异性结合，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，从而确定组织细胞内抗原的存在。具体而言，组织切片或细胞标本中的抗原首先与特异性的一抗结合，随后通过二抗与标记有显色剂的二抗结合，最终通过化学反应使显色剂产生颜色变化或荧光信号，这些信号在显微镜下可见，从而确定抗原的位置和表达水平。
三、IHC的应用领域
病理学研究：IHC在病理学研究中广泛应用，用于识别和定位组织中的特定蛋白，帮助病理学家进行疾病诊断和分类。
肿瘤研究：通过检测肿瘤组织中的特定抗原，IHC可以辅助肿瘤的诊断、分型和预后评估。
基础医学研究：IHC用于研究蛋白质在组织和细胞中的表达和分布，揭示其在生理和病理过程中的作用。
临床诊断：IHC在临床诊断中具有重要应用，如通过检测特定的肿瘤标志物来辅助癌症的诊断和治疗。
四、IHC实验所用的抗体
IHC实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
五、IHC实验所用的组织和细胞标本
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类。组织标本包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，细胞标本包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察。
六、石蜡切片的抗原修复
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。因此，在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法、高压加热法、酶消化法和水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
七、IHC常用的染色方法
根据标记物的不同，IHC染色方法分为免疫荧光法、免疫酶标法和亲和组织化学法。免疫荧光法使用荧光素标记抗体，通过荧光显微镜观察；免疫酶标法使用酶标记抗体，通过显色反应产生颜色变化；亲和组织化学法利用生物素-抗生物素系统，具有更高的敏感性。
八、抗体交叉反应的原因
抗体交叉反应指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外，还与其他抗原发生反应。产生的原因包括：抗原特异性、共同决定簇和决定簇相似。抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。决定簇相似指两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。
九、多抗和单抗特性比较
均一性：单抗中每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类，是一种纯度很高的均一抗体。多抗是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物，是多种种类和亚类Ig的混合物。
稳定性：单抗的稳定性较差，对pH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性。多抗的稳定性则较好。
特异性：单抗针对抗原的某一决定簇，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，特异性较差，较易引起交叉反应。
重复性：单抗的重复性好，多抗每批都不一样。
沉淀反应：多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
十、抗体的保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯、聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。
十一、IHC染色的质量控制和结果解析
IHC染色的质量控制包括组织的取材和固定、选择质量好的商品化抗体、恰当的选择和使用封闭和抗原修复手段、严格的技术操作和对照等。影响IHC染色质量的因素很多，如组织内待测抗原已被分解破坏、抗原含量过低、固定剂的使用不当及抗体质量不佳和稀释度不当等可出现假阴性反应；抗体与非待检抗原发生交叉反应、组织对抗体的非特异性吸附及内源性过氧化酶没有被阻断等还可出现假阳性结果。
十二、IHC染色的实验操作流程
组织处理和固定：将组织样本固定在适当的固定剂中，如福尔马林，以保持组织结构的完整性。
切片制备：将固定后的组织进行石蜡包埋或冷冻切片，制备成适合染色的组织切片。
脱蜡和复水：对于石蜡切片，需要进行脱蜡和复水处理，以去除石蜡并使组织切片恢复到适合染色的状态。
抗原修复：通过热修复或酶修复的方法，使抗原表位重新暴露，提高抗体与抗原的结合效率。
封闭：使用封闭液（如血清或蛋白溶液）封闭非特异性结合位点，减少背景染色。
一抗孵育：将特异性的一抗（针对目标抗原的抗体）与组织切片孵育，使抗体与抗原结合。
二抗孵育：使用标记有酶（如辣根过氧化物酶）的二抗与一抗结合，增强信号的强度和特异性。
显色：加入显色底物（如DAB），使酶催化产生可见的颜色反应，从而在显微镜下观察目标抗原的位置。
复染：使用苏木精-伊红等染料对细胞核等结构进行对比染色，以便更好地观察和分析。
封片：将染色完成的切片用盖玻片封片，以便于在显微镜下长期观察。
观察和分析：使用显微镜观察切片，并对目标蛋白的表达和定位进行分析。
十三、IHC染色的优势与挑战
优势：
高特异性和灵敏度：IHC通过特异性抗体与抗原结合，结合信号放大系统，能够实现高特异性和高灵敏度的抗原检测。
定位准确：IHC能够在组织或细胞的原位进行抗原检测，提供抗原在组织中的精确定位信息。
多种标记方式：IHC可以使用不同的标记物，如酶、荧光素、金属离子和同位素，以满足不同的实验需求。
挑战：
抗体选择：选择合适的抗体是IHC染色成功的关键，需要考虑抗体的特异性、灵敏度和种属来源。
背景染色：非特异性结合可能导致背景染色，影响结果的准确性，需要通过封闭和优化实验条件来减少背景染色。
实验条件优化：IHC染色技术需要优化多个实验条件，如抗体浓度、孵育时间和温度等，以获得最佳的染色效果。
十四、IHC染色技术的发展前景
随着生物医学研究的不断深入和技术的不断进步，IHC染色技术在多个领域展现出广阔的发展前景。例如，在肿瘤研究中，IHC染色技术可以用于检测肿瘤组织中的特定抗原，辅助肿瘤的诊断、分型和预后评估。此外，IHC染色技术还可以与其他技术结合，如多色IHC和免疫荧光技术，实现对多种抗原的同时检测，提供更丰富的信息。
十五、IHC染色技术的注意事项
抗体选择：选择经过验证的、适合IHC染色的抗体，确保抗体的特异性和灵敏度。
实验条件优化：优化实验条件，如抗体浓度、孵育时间和温度等，以获得最佳的染色效果。
背景染色控制：通过封闭和优化实验条件，减少非特异性结合导致的背景染色。
内源性酶阻断：如果样本中存在内源性酶活性，需要进行阻断处理，以减少背景染色。
十六、总结
IHC染色技术作为一项重要的生物医学研究和临床诊断工具，通过抗原与抗体的特异性结合，实现对组织或细胞中目标蛋白的精确定位、定性及相对定量分析。其高特异性、高灵敏度和多种标记方式使其在病理学研究、肿瘤研究、基础医学研究和临床诊断等领域具有广泛的应用前景。随着技术的不断进步和优化，IHC染色技术将继续为生物医学研究和临床诊断提供有力支持。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| IHC | HAB2192 | EA |
| Multiple IHC | mIHC-001-1次 | 1次 |
| Multiple IHC | mIHC-001-1次 | 1次 |
| 多色免疫组化试剂盒 | bulk-IHC-kit | kit |
