免疫荧光技术（IF-Fr）
1. 免疫荧光技术概述
免疫荧光技术（Immune Fluorescence, IF）是一种将免疫学方法与荧光标记技术相结合的技术，用于研究特异蛋白抗原在细胞内的分布。通过将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再利用荧光显微镜观察，可以对抗原进行细胞定位。这种技术具有靶向特异性强、灵敏度高、检测效率快、直观性强等优势，被广泛应用于基础科学及临床医学研究中。
2. 免疫荧光技术的原理
免疫荧光技术基于抗原与抗体特异性结合的原理。首先，将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光标记物。然后，将这种荧光标记物作为分子探针，检查细胞或组织内的相应抗原或抗体。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定其含量。
3. 免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术主要分为以下几类：
直接法：直接将荧光素标记的抗体用于检测细胞或组织内的抗原。
间接法：先用未标记的抗体与细胞或组织内的抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。
夹心法：将抗原夹在两个抗体之间，其中一个抗体标记有荧光素。
补体法：利用补体系统进行检测，其中一个成分标记有荧光素。
4. 免疫荧光技术的实验步骤
免疫荧光实验的步骤通常包括以下几个环节：
样品准备：根据实验需求，准备不同的样品。针对贴壁细胞，可将洁净的盖玻片放置在培养皿中，待细胞接近长成单层后小心取出盖玻片；针对悬浮细胞，可在悬浮液中进行固定、染色、离心洗脱后，用移液管移至载玻片进行后续抗体孵育；针对组织样品，可能需要进行脱蜡、再水化和抗原修复处理等。
固定：使用固定液对样品进行固定，以防止自溶和抗原扩散。固定的时间和方法取决于抗原的性质及抗体的特性。例如，常使用4%的多聚甲醛固定细胞10 ~ 15 min。
洗涤：使用PBS缓冲液清洗3次，以去除残留的固定液。
抗原修复：前期的固定过程可能会发生交联，交联过程会导致抗原发生封闭现象，使目标抗原无法准确显露出来，最终导致假阴性结果，从而影响免疫荧光结果的判断。常用的抗原修复方法包括高温高压、微波加热或酶处理等。
通透：使用Triton X-100等去垢剂或醇类试剂进行通透处理，以使抗体能够进入细胞内部。通透时间通常为5 ~ 20 min。
洗涤：使用PBS缓冲液清洗3次，以去除残留通透液。
封闭：添加山羊血清或牛血清白蛋白（BSA）等封闭液覆盖样品，以减少一抗/二抗与非特异性抗原位点的结合。室温或37 ℃封闭30 ~ 60 min。
一抗孵育：根据目标抗原和样品特性选择符合要求的一抗，并按照说明书要求稀释一抗，加入到样品中并在4 ℃条件下孵育过夜（12 ~ 16 h）。
洗涤：回收一抗工作液，用TBST或PBST摇床缓慢清洗3次，每次5~10 min，以去除未结合的抗体。
二抗孵育：根据一抗的种类及样品特性（二抗携带的荧光需要与样品自带荧光不冲突）选择合适的荧光标记的二抗，在室温下避光孵育1 h。
洗涤：去除/回收二抗工作液，用TBST或PBST摇床缓慢清洗3次，每次5 ~ 10 min，以去除未结合的抗体。
染核：为直观地区分细胞核和其他细胞及抗原结构的位置，可使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂对样品进行染核和封片处理，通常在室温下进行，孵育5 ~ 20 min。
成像及分析：最后，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，并对荧光定位及结果进行实验分析。
5. 免疫荧光技术的应用
免疫荧光技术在基础实验研究和临床医学研究中具有广泛的应用，例如药物对蛋白的作用影响、蛋白的特异性表达、细胞表面抗原的检测、肿瘤特异性抗原检测、病毒的快速确认以及血清中抗体的检测等。
用于靶标蛋白及表达特异性定位的研究：例如，滨州医学院肾脏生理与疾病研究团队在《Nature Communications》杂志在线发表了题为“Loss of CLDN5 in podocytes deregulates WIF1 to activate WNT signaling and contributes to kidney disease”的研究论文。该研究首次揭示了足细胞紧密连接跨膜蛋白CLDN5可调控WNT通路抑制分子WIF1的表达并参与肾脏病的发生发展。其中免疫荧光染色显示，CLDN5在Cldn5podKO肾脏中没有与NPHS2共定位，但在小动脉内皮细胞中有信号，证实NPHS2-cre介导的CLDN5缺失主要局限于足细胞。
用于细胞器定位的研究：例如，瑞典皇家理工学院在《Science》杂志上发表了题为“ A subcellular map of the human proteome”的研究论文。研究团队整合了人类转录组学、免疫荧光技术和质谱验证等，首次绘制出了人体蛋白质亚细胞结构分布的全景图，在单细胞水平将由13993种抗体靶向的12003种蛋白定位到30个细胞区室和亚结构中。
定量多重免疫荧光（qmIF）用于分析肿瘤免疫微环境：例如，美国哥伦比亚大学系统生物学系的Junfei Zhao和Andrew X. Chen在《Nature Medicine》杂志发表了题为“Immune and genomic correlates of response to anti-PD-1 immunotherapy in glioblastoma”的关于胶质母细胞瘤（glioblastomas，GBM）免疫治疗的文章。研究分析了17位患者应答PD-1抑制剂治疗前后的石蜡包埋染色样本，发现CD68+HLA-DR-的巨噬细胞在PTEN突变的样本中比例显著升高，而免疫治疗后，PTEN野生型的样本中CD3+T细胞（CD8+/-）密度显著升高，PTEN突变型样本中则不具有相关变化。
6. 免疫荧光技术的研究进展
近年来，免疫荧光技术在多个维度上均取得了令人瞩目的研究进展。
技术原理与优化的深入：研究者们对TSA技术的原理进行了更为深入的探究，并在此基础上进行了多项优化。例如，通过改进荧光染料的化学结构，提高了其稳定性和光亮度，使得染色效果更为清晰、持久。同时，对信号放大过程的精细调控，也进一步提升了TSA技术的灵敏度和特异性。
多色标记与高通量分析的实现：TSA多色免疫荧光技术的核心优势在于能够在同一组织切片上实现多个靶标蛋白的共同染色。近年来，随着技术的不断进步，多色标记的准确性和高通量分析能力得到了显著提升。研究者们已经能够成功实现数十种蛋白的共染色，并通过对荧光图像的深入分析，揭示出组织微环境中的复杂信息。
临床应用与转化的拓展：TSA多色免疫荧光技术在临床应用方面也取得了重要突破。越来越多的研究开始探索其在肿瘤、神经科学、发育生物学等领域的应用潜力。例如，在肿瘤研究中，该技术能够揭示肿瘤与免疫细胞之间的相互作用关系，为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和方法。
新试剂盒与产品的不断涌现：随着TSA多色免疫荧光技术的不断发展，市场上出现了越来越多与之相关的试剂盒和产品。这些试剂盒和产品不仅提高了实验的准确性和效率，还降低了实验成本和时间成本，使得更多研究者能够使用该技术进行科学研究。
7. 免疫荧光技术的常见问题及解析
在免疫荧光实验中，常见的问题及解析如下：
抗体的选择与转染实验荧光蛋白选择的影响：若使用病毒、质粒或其他载体用于细胞或动物的转染/感染来研究基因/蛋白的功能影响时，载体携带了荧光蛋白，则二抗荧光选择时或载体荧光蛋白选择时，荧光蛋白和二抗携带荧光素的激发波长和发射波长应互相不能干扰，防止影响正确的荧光结果的观察。
显微镜下观察，免疫荧光信号较弱：若显微镜下观察荧光信号较弱，需要考虑靶标蛋白丰度低、固定方法不当、通透方法不当、一抗影响、二抗影响、信号放大不够、荧光淬灭等因素。
在显微镜下观察荧光图像时，背景过高：若显微镜下观察背景过高，需要考虑自发荧光的影响、封闭不足、一抗影响、二抗影响、组织切片预处理不当等因素。
免疫荧光实验怎么避免非特异性染色结果：可以前期加强封闭和洗涤的次数和时间；若一抗不特异需要更换一抗产品，若一抗浓度过高，需要降低其浓度；也可以更换更特异的二抗。
8. 结论
免疫荧光技术作为一种重要的生物医学研究工具，具有广泛的应用前景。通过不断优化实验步骤和提高技术的灵敏度和特异性，免疫荧光技术在基础研究和临床应用中将继续发挥重要作用。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Mouse Immune Cell Phenotyping IHC Antibody Sampler Kit | 37495T | 1Kit |
| Senescence beta-Galactosidase Activity Assay Kit (Fluorescence, Flow Cytometry) | 35302S | 1Kit |
| Engineered Immune Cell Express Mode Package | 160-003-349 | EA |
| BioTek Fluorescence Test Plate | 1400501 | EA |
