抗药抗体（ADAs）检测方法的开发与优化

抗药抗体（ADAs）

抗药抗体（ADAs）的出现对生物治疗药物的生物活性和毒性产生重大影响，因此，开发可靠的检测方法来监测血液样本中ADAs的含量是生物治疗药物研发过程中的关键任务。肽类治疗药物作为一类重要且快速发展的生物治疗药物，用于治疗多种疾病。尽管肽类通常具有较低的免疫原性风险，但仍需按照监管机构的要求进行基于风险的免疫原性评估。

1. 引言

肽类是由少于40个氨基酸组成的聚合物，作为一类强大的生物治疗药物，正逐渐应用于多种疾病的治疗。抗药抗体（ADAs）的产生可能通过改变生物治疗药物的疗效、药代动力学和药效学（PK/PD）特征而限制其临床应用。因此，监管机构要求药物研发人员在药物研发过程中尽早实施基于风险的免疫原性评估策略，密切监测抗药免疫反应。

2. 材料和方法

2.1. 试剂和材料

醋酸司美格鲁肽购自开曼化学公司（美国密歇根州安阿伯市）。
线性司美格鲁肽由金斯瑞公司（中国江苏南京）合成。
肽T1和T2为内部制备。
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin购自赛默飞世尔科技（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。
MSD GOLD Sulfo Tag NHS-Ester和ECLIA检测板购自Meso Scale Discovery（MSD，美国马里兰州罗克维尔市）。
生物素-马来酰亚胺购自Vector Laboratories（美国加利福尼亚州纽瓦克市）。
重组蛋白A/G和A/G/L分别购自赛默飞世尔科技（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）和Novus（美国科罗拉多州森特尼尔市）。
小鼠、狗和猴的同型对照免疫球蛋白G（IgG）购自Southern Biotech（美国阿拉巴马州伯明翰市）。
兔和人IgG的同型对照分别购自BioXCell（美国新罕布什尔州黎巴嫩市）和Jackson Immuno Research（美国宾夕法尼亚州西格罗夫市）。
抗司美格鲁肽兔多克隆抗体由Creative Diagnostics（美国纽约州雪莉市）提供。
兔抗T1和T2多克隆抗体由无锡药明康德（中国江苏苏州）生产。
钌标记的山羊抗人、山羊抗兔IgG和链霉亲和素购自MSD。
胰凝乳蛋白酶购自Promega（美国威斯康星州麦迪逊市）。
Superblock™、Blocker™Casein、Staringblock™和无蛋白封闭缓冲液购自赛默飞世尔科技（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。
牛血清白蛋白购自Millipore Sigma（美国密苏里州圣路易斯市）。
Chonblock封闭缓冲液购自Chondrex（美国华盛顿州伍丁维尔市）。
所有物种的K2EDTA血浆购自BioIVT（美国纽约州希克斯维尔市）。

2.2. 关键生物共轭试剂的制备

LBA所需的共轭生物试剂通过NHS-酯或马来酰亚胺反应制备。对于NHS-酯反应，在加入NHS-酯修饰的生物素或钌之前，将肽和蛋白质溶解在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.9）中。反应在室温下进行1小时，随后产物在10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4，内部制备）中透析过夜，以去除过量的NHS-酯。对于马来酰亚胺反应，将过量的生物素-马来酰亚胺与悬浮在10 mM PBS（pH 7.4）中的肽在室温下混合4小时，然后进行透析。使用Bradford法或快速金BCA法测定肽和蛋白质浓度。根据制造商提供的手册中的方法计算钌的结合率。

2.3. 生物素化肽的MS鉴定

生物素化的司美格鲁肽在37°C下用胰凝乳蛋白酶消化过夜，然后通过加入终浓度为0.1%的三氟乙酸（TFA，pH 2.0）淬灭反应，再使用ZipTip C18树脂（Millipore Sigma，美国密苏里州圣路易斯市）进行脱盐。简要地说，ZipTip依次用100%甲醇、50%乙腈/0.1% TFA和0.1% TFA水溶液进行预处理。肽用60%乙腈/0.1%甲酸洗脱，通过SpeedVac浓缩器（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）干燥，然后在5%乙腈/0.1%甲酸中复溶。

使用UltiMate™3000 RSLC-nano LC系统（赛默飞世尔科技，美国加利福尼亚州桑尼维尔市）与Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪（赛默飞世尔科技，美国加利福尼亚州圣何塞市）联用进行LC-MS/MS分析。简要地说，消化后的肽首先加载到Acclaim™PepMap™C18 Trap柱（75 µm × 150 mm，3 µm，100 Å）上，然后以300 nL/min的流速用0.1%甲酸中8-40%乙腈的线性梯度洗脱到EASY-SprayTM C18反相柱（50 µm x 15 cm，2 µm，100 Å）上，洗脱时间为60分钟。在375-1400 m/z范围内以120,000的分辨率记录MS和MS/MS光谱，循环时间为3秒。

2.4. ECLIA检测步骤

本研究涉及三种形式的ECLIA，即桥接、反向结合和直接结合。孵育步骤在室温下以600 rpm的轨道振荡进行。所有洗涤步骤均在BioTek 405 LS微孔板洗涤器（BioTek，美国佛蒙特州威努斯基市）上用PBS/0.05% Tween 20作为洗涤缓冲液进行三次。使用QuickPlex SQ 120MM酶标仪在2×MSD缓冲液T中测量相对光单位（RLUs）。所有样品均进行双份检测。

使用组特异性空白血浆的RLUs作为背景计算信噪比（S/N）值。详细的检测程序如下：

桥接格式：用150 µl检测缓冲液封闭MSD链霉亲和素包被板60分钟，轻拍干燥，然后加入50 µl生物素化肽孵育90分钟。洗涤后，加入稀释的血浆样品，孵育60分钟以使ADA充分结合。
反向结合格式：对于反向结合策略，将MSD高结合板在4°C下用蛋白A/G包被过夜，不振荡。第二天洗涤并封闭板后，加入稀释的血浆样品孵育60分钟，然后用钌标记的肽或生物素化肽与钌偶联的链霉亲和素进行ECL信号检测。
直接结合格式：用检测缓冲液封闭链霉亲和素包被板，然后加入生物素化肽孵育90分钟。多次洗涤以去除未结合的肽后，将在检测缓冲液中稀释的血浆样品转移到预处理的板上孵育60分钟。洗涤三次后，加入钌标记的蛋白A/G或抗人/兔IgG鸡尾酒以产生ECL信号。

2.5. 截断点Cut Point和灵敏度的确定

根据Shankar等人描述的行业标准方法计算初步筛选截断点因子（SCP）和确证性截断点（CCP）。在本概念验证研究中，纳入30份未接触过药物的人血浆（50%男性和50%女性）来计算S/N和抑制百分比（%Inh）的平均值和标准差（SD）。通过Tukey箱线图法识别异常值，其中上限和下限定义为Q3 + 1.5×(Q3 - Q1)和Q1 – 1.5×(Q3 - Q1)，Q1和Q3分别代表数据池的第25和第75百分位数。SCP和CCP的确定基于数据池的平均值、中位数、标准差（SD）和中位数绝对偏差（MAD）。用于计算的公式如下：

浮动SCP因子（5%假阳性率[FPR]）：
- 参数法：(mean [S/N] + 1.645×SD [S/N])/mean (S/N)
- 稳健参数法：(median [S/N] + 1.645×1.483×MAD [S/N])/median (S/N)
- 非参数法：S/N数据池的第95百分位数
CCP（1% FPR）：
- 参数法：mean (% Inh) + 2.33×SD (% Inh)
- 稳健参数法：median (% Inh) + 2.33×1.483×MAD (% Inh)
- 非参数法：% Inh数据池的第99百分位数

2.6. 软件和统计分析

所有原始MSD数据均由Methodical Mind（MSD，美国马里兰州罗克维尔市）采集。使用Prism 9（Graphpad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥市）进行数据的偏度和正态性分析。使用Byonic 5.5（Protein Metrics，美国加利福尼亚州库比蒂诺市）分析MS光谱。

3. 结果与讨论

3.1. 关键试剂制备和检测格式比较

为开发适用于多种TPeps的通用方法，我们首先需要选择一种符合以下标准的模型化合物：1）其结构和设计应符合TPep设计的主要趋势；2）必须有相应的阳性对照（PC）抗体（最好是商业来源的现成产品）。因此，我们选择了脂质化的GLP-1R激动剂司美格鲁肽进行研究。同时，化学合成了无侧链的线性司美格鲁肽（L-Sema），以代表未脂质化的肽类治疗药物。

ADA检测通常需要将测试物与功能基团（如生物素、钌）偶联。由于司美格鲁肽经脂质衍生化后缺乏游离赖氨酸残基，位于N-末端的α胺似乎是进行胺反应性偶联的唯一可用位点。我们测试了在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.9）中室温下通过NHS-酯反应使肽生物素化1小时的可行性。如图S1所示，通过对胰凝乳蛋白酶消化后释放的N末端片段进行LC/MS-MS分析，证实了产生了具有N末端NHS-LC-biotin修饰（+339.161662）的生物素化司美格鲁肽。在相同条件下，随后使用SULFO-TAG NHS Ester制备了钌标记的司美格鲁肽。

首先，我们比较了各种检测格式的性能。在所有检测格式中，桥接检测（图1A）由于背景低、灵敏度高且对各种基质具有广泛适应性，被认为是ADA检测最可接受的格式。为进行桥接格式的ADA检测，将生物素化和钌标记的药物分子与ADA样品混合，以形成桥接复合物（图1A，顶部），随后可在MSD系统上进行分析。在初步阶段使用Superblock™作为封闭/稀释缓冲液。如图1A所示，在使用食蟹猴和人血浆进行多轮条件优化后，S/N比仍不理想，在500 ng/ml的PC浓度下，信号仅略高于基线，这可能是由于钌标记不足导致信号放大效果不佳。对于偶尔用于非抗体生物制剂的反向结合策略，由于检测板被大量内源性免疫球蛋白占据，检测信号仍然较低（图1B）。幸运的是，使用1 ng/ml钌标记的蛋白A/G进行检测时，直接结合格式的信号有了显著改善，在500 ng/ml PC时S/N高于2.0（图1C）。这一初步结果虽然仍不令人满意，但为进一步优化检测方法奠定了基础。

接着，我们研究了在直接结合格式中，小斑点检测板是否比常规检测板具有更好的性能。如图1D所示，使用小斑点检测板时S/N值有了极大的提高。不同的最小稀释比（MRD）从1:10到1:50，在所有检测的PC浓度下都产生了相似的S/N。因此，我们在小斑点检测板上进行直接结合检测时采用1:20的MRD。

对于直接格式的ADA检测，检测试剂应能够检测替代PC和实际ADAs，而它们通常来自不同物种。据报道，钌标记的蛋白A/G可作为检测针对无Fc区生物制剂的ADAs的检测试剂。虽然蛋白A/G可用作跨物种IgG结合剂，但它与不同物种IgGs的结合亲和力可能不同，因此提前评估替代抗体和实际抗体是否能同等检测至关重要。如图S2A所示，来自兔、狗、猴和人的IgGs的检测效率相似。然而，小鼠IgG虽然可检测，但效率明显较低。这一结果表明在检测方法开发中可能存在替代抗体和实际ADA检测不均衡的问题。虽然使用蛋白A/G/L检测在一定程度上减少了这种差异（图S2），但在抗司美格鲁肽ADA检测中，其ECL信号明显低于蛋白A/G（图1E）。综上所述，我们在接下来的人ADA检测可行性研究中选择重组蛋白A/G。然而，如果在小鼠研究的检测中使用兔源PC，蛋白A/G/L可能是更可靠的选择，尽管可能会牺牲检测灵敏度。

3.2. 基于蛋白A/G的ADA检测性能评估

对30份未接触过药物的人血浆进行两次测试（共60个数据点），以确定抗司美格鲁肽ADA检测的SCP（5% FPR）和CCP（1% FPR）。在二级（确证性）检测中，在样品稀释前将10 µg/ml未标记药物加入检测缓冲液。由于数据数量不足以进行正态性检验，我们使用三种成熟的统计方法（参数法、稳健参数法和非参数法）计算SCP和CCP。通过箱线图法确定两个SCP数据点为异常值，并将其排除在SCP计算之外。此外，还有四个数据点的%Inh值超出了Tukey箱线边界，也相应地被移除。最终，分别使用58个和54个数据点计算SCP和CCP，通过Shankar等人认可的三种统计方法确定95%浮动SCP和99%浮动CCP分别约为1.8和42%（图2A）。基于SCP和CCP结果，估计筛选和确证灵敏度约为100 ng/ml（图2B-C），接近FDA最新建议的边缘。

然后，我们在该检测平台上测试了内部候选TPep分子T1和T2。对于T1，约100 ng/ml的灵敏度可能实现，而对于T2，500 ng/ml PC的S/N约为1.7，表明灵敏度较差，可能在500到1000 ng/ml之间，这可能归因于PC的质量（图2D）。总之，基于蛋白A/G的检测不能作为一种通用方法始终提供理想的灵敏度。基于蛋白A/G的直接检测的另一个缺点是无法检测非IgG抗体，尽管它们在总ADA中所占比例较小。据Johnson等人报道，蛋白A/G无法以与IgG相当的灵敏度检测IgM和IgE。

3.3. 直接检测格式的不同检测缓冲液比较

LBA的性能在很大程度上受检测缓冲液选择的影响。我们接着研究使用替代的封闭/稀释缓冲液而不是Superblock™是否会导致更高的S/N值和更低的检测背景。随后比较了五种其他缓冲液，即Blocker™Casein、Chonblock、Startingblock、3%BSA和无蛋白缓冲液与Superblock™的效果。对于不含洗涤剂的缓冲液，添加了0.05% Tween-20。

如图3所示，与Superblock™相比，Blocker™Casein显示出更低的背景信号和相似的S/N。相反，使用3%BSA缓冲液即使在微克/毫升水平的PC下也导致极差的S/N。有趣的是，去除脂质侧链后检测信号得以恢复。我们推测这是因为BSA是脂肪酸的结合伙伴，会在板结合的脂质化肽上形成屏蔽层，从而阻碍了后续步骤中ADAs与肽的相互作用。因此，在检测方法开发中建议使用无白蛋白缓冲液。使用Blocker™Casein显著提高了检测的一致性，表现为重复孔之间的变异系数显著降低（图S3A），这无疑有助于检测验证的通过率。不幸的是，尽管Blocker™Casein表现出较低的SCP和CCP，可能会提高灵敏度（图S3B），但改进有限，对于T2可能无法达到满意的结果。

3.4. 抗物种抗体作为二次检测试剂可提高检测灵敏度

蛋白A/G检测灵敏度不足促使我们探索替代的二次检测试剂，如用于TPeps特异性ADA检测的抗物种抗体。由于替代ADA PCs通常在免疫动物（如兔）中产生，因此需要抗替代和抗人抗体的混合物用于ADA检测和质量控制。目前对于如何适当地制备用于ADA和/或PC检测的检测混合物尚无共识。在我们的研究中，将一系列不同物种的同型对照IgGs固定在MSD板上，并进行二次抗体的滴定研究。合适的二次抗体对应在不同水平的板结合IgGs上产生可比的ECL信号。如图S4所示，50 ng/ml钌标记的山羊抗兔（目录号R32AB）和50 ng/ml山羊抗人IgG（目录号R32AJ）（与Wang等人的条件相同）在与板结合的IgG同型对照上表现出可比的信号发展。因此，这种1:1混合的50 ng/ml钌标记的山羊抗兔和抗人二次抗体被用作后续检测方法开发的检测混合物。由于检测灵敏度不足，未选择另一批次的抗人IgG（目录号D20JL）。

与蛋白A/G类似，基于二次抗体的检测也不是一种泛同型方法。为了能够检测非IgG ADAs，研究人员可以考虑：a）使用包含抗IgM和（或）IgE的二次抗体混合物；b）使用轻链特异性抗体，如抗kappa/lambda抗体，以实现对非IgG ADAs的检测。此外，可以开发专门的检测方法，使用相关的二次抗体（可能需要同型特异性单克隆PC）来特异性检测其他同型。

使用Blocker™Casein作为检测缓冲液，升级方法的SCP（5% FPR）和CCP（1% FPR）值分别约为1.9和25%，分别来自54个和50个排除异常值的数据点。在ADA检测中，各个未接触药物的血浆样本之间相对较高且可变的RLU值导致高SCP，这是直接格式免疫检测的一个缺点。批间不一致性可能是所有疫苗诱导抗体和自身抗体以及ADAs的血清学抗体检测的固有特征。值得注意的是，与Johnson等人的研究相比，我们的检测背景变异似乎更低（图S5）。

实际上，使用抗兔/人IgG抗体在司美格鲁肽31.25 ng/ml的PC浓度下产生了约2.0的S/N，这比之前描述的方法有了显著改进。即使对于检测开发面临更大挑战的T2，根据2.0的临时SCP，在新策略下似乎也可以实现低于推荐的100 ng/ml的筛选灵敏度。对于T1，筛选灵敏度可能达到低ng/ml甚至pg/ml水平（图4D）。三种检测格式的详细统计参数记录在表S1和S2中。

总体而言，我们的检测显示出出色的筛选灵敏度，与替尔泊肽的数据（2.8 ng/ml）相匹配，并且优于之前报道的基于放射免疫分析的司美格鲁肽数据（69 ng/ml）。

然而，我们明白阴性样本之间的高背景变异导致相对较高的SCP，这是一个难以克服的障碍。有人认为，IgG与固体基质的非特异性结合是抗原降低血清学检测中信号变异的主要来源。我们试图利用替代缓冲液来降低阴性血浆批次的内在变异，但未能找到比Blocker™Casein效果更好的缓冲液（内部数据，未显示）。

ADA检测开发中的另一个重要考虑因素是药物耐受性。特别是对于经过工程改造以延长半衰期的长效TPeps，在采集样本时可能仍存在未清除的药物。如图4E所示，在PC样本中预先添加5 µg/ml司美格鲁肽（约1.25 µmol/L）后，鉴于S/N为1.95，31.25 ng/ml的PC仍有可能被检测到。这一发现表明了基于抗体检测的直接结合ECLIA策略具有较强的药物耐受性。

我们观察到针对司美格鲁肽、T1和T2的检测灵敏度存在差异，这可能归因于PC亲和力的不同。实际上，在开发抗药抗体（ADA）检测方法时，选择合适的PC仍然是一个重大挑战。ADAs本身具有可变性，在物种、个体之间以及随时间而变化。虽然灵敏度、选择性、精密度、药物耐受性等参数是检测性能的内在属性，但它们只能使用选定的替代PCs进行评估。对于总ADA检测，pAbs作为PCs可能比mAbs更合适，因为它们的克隆组成多样，更能模拟自然发生的ADAs的复杂性。然而，pAb生成过程中涉及的重复免疫可能无法完全复制动物或人类在药物给药期间观察到的免疫反应。持续的研究和数据积累对于建立准确反映临床有意义的免疫原性反应的ADA检测开发最佳实践至关重要。

3.5. 肽的结合位点影响检测性能

通过NHS-酯进行的胺偶联化学常用于生成ADA检测的关键试剂。然而，与位点特异性偶联相比，传统方法的随机标记可能会由于ADA表位的中断而导致检测灵敏度降低。此外，根据一些报道，在极少数情况下可能会发生在非赖氨酸残基上的标记。由于肽的尺寸有限，这一问题对肽尤为重要。因此，我们研究了使用替代生物素化位点是否可以进一步改进检测方法。通过马来酰亚胺反应使用在每个末端具有一个额外半胱氨酸的T2衍生物制备了N和C末端生物素化的T2。

如图5所示，虽然所有组在基于二次抗体的ECLIA检测中都表现出令人满意的性能，但C-生物素化的T2作为ADA捕获试剂比N末端生物素化以及主要具有N-末端生物素化的胺标记的T2产生了明显更高的S/N。这一结果表明，一定比例的抗肽pAb将末端基团识别为表位，这为进一步提高检测灵敏度提供了一种备用方法。

4. 结论

通过对直接结合工作流程中的多个因素进行逐步优化，本研究开发并表征了一种优化的ECLIA方法，用于检测人血浆中针对TPeps的ADAs。缓冲液、检测试剂、检测板类型和偶联策略等关键因素在检测性能中起着至关重要的作用。我们的检测策略对三种测试化合物在低至个位数到两位数ng/ml范围内表现出优异的灵敏度，并且可以作为具有类似设计的多种TPeps的通用检测策略。以本流程为基础，各个生物分析实验室可以根据药物分子的特性和研究要求进一步优化流程，以实现所需的检测性能。如果您对MSD电化学发光技术或相关检测方法有更多兴趣，欢迎了解MSD超敏高通量多因子分析系统，该系统提供了更全面和深入的技术信息。