斑点印迹（Dot Blotting）
一、技术概述
斑点印迹（Dot Blotting）是一种直接检测核酸或蛋白质的技术，通过将待测生物分子点样于固相载体（如硝酸纤维素膜或尼龙膜），利用探针或抗体特异性结合的原理实现定性或半定量分析。相较于需要电泳分离的Western Blotting技术，Dot Blotting简化了实验流程，适用于高通量样本筛查和快速验证 。
硝酸纤维素膜点样示意图
二、技术原理与核心优势
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静电吸附机制
硝酸纤维素膜或尼龙膜表面带有强静电吸附力，可在中性条件下直接吸附DNA、RNA或蛋白质等生物大分子，形成稳定的固相复合物 。 -
标记检测系统
- 核酸检测：使用同位素或荧光标记的探针进行杂交。
- 蛋白质检测：通过一抗结合目标蛋白，二抗携带酶标记（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP），最终与底物反应显色 。
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核心优势
- 高通量：单张膜可同时检测数十至数百个样本。
- 快速高效：省去电泳和转膜步骤，实验周期缩短50%以上。
- 灵敏度：可检测低至0.01%的稀有蛋白或核酸分子 。
三、实验操作全流程
1. 样本制备
- 核酸样本：需变性处理（如100℃加热5分钟，冰浴骤冷）以暴露结合位点 。
- 蛋白质样本：避免使用含金属离子（如Ca²⁺、Mg²⁺）的缓冲液，以防干扰后续检测 。
2. 点样与固定
- 手动点样：用微量移液器将2-5 μL样本点于膜上，自然风干或37℃烘烤30分钟。
- 仪器辅助：使用多管吸印仪（如Bio-Dot）实现标准化点样，减少人为误差 。
- 固定方法：80℃真空烘烤2小时或紫外交联（254 nm，120 mJ/cm²） 。
多管吸印仪操作示意图
3. 封闭与孵育
- 封闭液：5%脱脂奶粉或BSA溶液，室温封闭1小时，阻断非特异性结合位点 。
- 一抗孵育：稀释后的一抗（如1:1000）4℃过夜或室温震荡1小时。
- 二抗孵育：HRP标记二抗（如1:5000）室温孵育1小时，TBST洗涤3次 。
4. 信号检测
- 化学发光法：ECL显色液（如A/B液混合）覆盖膜表面，暗室曝光X光胶片或使用成像系统采集信号 。
- 比色法：适用于碱性磷酸酶系统，底物（如NBT/BCIP）显色后直接观察斑点强度 。
四、应用场景
- 快速筛查
- 临床诊断：检测病原体核酸（如HPV、HCV）或自身抗体 。
- 药物开发：高通量筛选候选药物对靶蛋白的抑制作用 。
- 半定量分析
- 基因表达：比较不同样本中特定mRNA或蛋白质的表达水平 。
- 质量控制：评估重组蛋白纯化效率或疫苗抗原浓度 。
- 功能验证
- 表位定位：通过重叠肽段点样鉴定抗体结合区域 。
- 互作研究：检测DNA-蛋白质或蛋白质-配体相互作用 。
斑点印迹结果示例
五、与Western Blotting的对比分析
| 指标 | Dot Blotting | Western Blotting |
|---|---|---|
| 样本处理量 | 单次检测≥96样本 | 单次检测≤10样本 |
| 实验周期 | 6-8小时 | 24-48小时 |
| 分辨率 | 无分子量区分 | 可分辨分子量差异 |
| 定量能力 | 半定量（灰度分析） | 半定量（条带强度） |
| 适用场景 | 初筛、大样本验证 | 精细分析、特异性验证 |
文献综合分析
六、关键注意事项
- 膜处理
- 硝酸纤维素膜需预湿于SSC缓冲液，尼龙膜需紫外交联增强结合力 。
- 避免膜未完全干燥时点样，防止样本扩散 。
- 抗体选择
- 优先选择经Dot Blot验证的抗体，或Western Blot特异性抗体 。
- 定制抗体时需验证金属标签偶联效率（如镧系元素标记） 。
- 结果解读
- 设置阳性和阴性对照，排除非特异性信号 。
- 使用ImageJ软件进行灰度分析，标准化至内参蛋白 。
七、技术局限与改进方向
- 局限性
- 无法区分分子量相近的蛋白或核酸异构体。
- 半定量结果受点样均一性和显色条件影响较大 。
- 创新解决方案
- 微阵列技术：结合自动化点样系统，提升检测通量和精度 。
- 多重检测：使用不同金属标签抗体，实现单膜多靶标同步分析 。
- 数字成像：整合AI算法自动识别斑点强度，减少人为误差 。
结语：从实验室到临床的桥梁
自1970年代发展至今，Dot Blotting凭借其高效、灵活的特点，已成为分子生物学研究的基石技术。在精准医学时代，其与质谱流式（CyTOF）、单细胞测序等技术的结合，将进一步推动疾病标志物发现和个性化治疗的发展 。正如古人以“点石成金”追求转化，现代科研者正通过微点中的信息，解码生命的奥秘。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| TrueBlack ® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit | 40683S | 1Kit |
| Minifold I Spot-Blot System, complete 96-well (acrylic) | 10447850 | EA |
| rhMcl-1 Western Blot (100 uL) | WBC003 | 100uL |
| rhMMP-2 Western Blot (1 Vial) | WBC025 | 1Vial |
