蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术全解析

蛋白质免疫印迹

一、技术定义与历史发展

蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）是一种基于抗原-抗体特异性结合原理的蛋白质检测技术。其核心流程包括：通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转印至固相载体，利用特异性抗体进行靶标识别，最终通过化学发光或荧光信号实现可视化检测 。

该技术起源于1979年Towbin等人的开创性研究，经过四十余年的发展，已成为分子生物学实验室的标准技术。2023年全球WB试剂市场规模已达18亿美元，年复合增长率达6.2%（Grand View Research数据）。

二、核心实验原理

1. 技术三要素

要素	功能解析
电泳分离	SDS-PAGE根据分子量差异分离蛋白质，分辨率可达1kDa
转印固定	电场驱动蛋白质从凝胶转移至PVDF/NC膜，保留空间分布信息
免疫检测	一抗特异性识别，二抗标记（HRP/荧光染料）放大信号，灵敏度达pg级

2. 关键分子机制

• SDS-PAGE变性：SDS与蛋白质按1.4g/g比例结合，消除电荷差异，使迁移率仅与分子量相关 
• 转印效率优化：半干转（15-60min）适合小分子量蛋白，湿转（60-150min）适用＞60kDa大分子 
• 信号放大系统：HRP-ECL化学发光灵敏度比传统显色法高100倍，可检测0.1ng靶蛋白 

三、标准操作流程

▶ 第一阶段：样品制备

1. 裂解提取

• 使用RIPA裂解液（含1% Triton X-100、0.1% SDS）
• 添加蛋白酶抑制剂（如1mM PMSF），冰上操作防止降解 ^

2. 浓度测定

方法	检测范围	干扰因素
BCA法	20-2000μg/mL	兼容1% Triton，不耐受EDTA
Bradford法	1-100μg/mL	易受去垢剂影响，需做空白对照

 

3. 样品处理

• 按4:1比例混合样品与5×Loading Buffer
• 95℃加热5分钟使蛋白线性化 

▶ 第二阶段：SDS-PAGE电泳

1. 制胶参数

胶类型	分离范围	丙烯酰胺浓度
浓缩胶	无分离功能	4%
12%分离胶	10-200kDa	12%
8%分离胶	50-300kDa	8%

2. 电泳条件

• 浓缩胶：80V恒压（20-30min）
• 分离胶：120V恒压（60-90min），溴酚蓝迁移至胶底部停止 

▶ 第三阶段：转印与封闭

1. 转膜系统选择

类型	适用场景	效率对比
湿式转印	大分子量蛋白（＞100kDa）	★★★★☆
半干转印	快速检测（15-30min）	★★★☆☆
干式转印	高通量筛选	★★☆☆☆

2. 封闭液对比

封闭剂	适用场景	注意事项
5%脱脂奶粉	常规检测	含酪蛋白，禁用于磷酸化检测
3%BSA	磷酸化/糖基化蛋白	成本较高
专用封闭剂	高背景样本	需验证兼容性

四、技术创新与优化

1. 荧光Western技术

• 采用Alexa Fluor系列染料（如647/790nm）
• 支持多重检测（4-7个靶标同步分析）
• 需使用低自发荧光PVDF膜（如Immobilon-FL） 

2. 自动化系统

• Bio-Rad TurboBlot系统：转印时间缩短至3-7min
• 全自动WB工作站：整合电泳、转印、检测全流程，通量提升5倍 

五、典型应用场景

1. 基础研究

• 信号通路验证：检测磷酸化ERK（42/44kDa）激活状态 
• 亚细胞定位：通过膜蛋白（Na+/K+-ATPase）与胞浆蛋白（GAPDH）对比

2. 临床应用

• HIV诊断：检测gp120/41抗原，特异性＞99.8%
• 肿瘤标志物：HER2检测指导乳腺癌靶向治疗

六、常见问题解析

现象	原因分析	解决方案
非特异性条带	一抗浓度过高/封闭不充分	优化抗体稀释比（1:500-1:2000）
信号微弱	转印效率低/二抗失活	预染Marker验证转印完整性
背景过高	膜干燥/洗涤不充分	增加TBST洗涤次数（5×5min）

七、未来发展方向

• 微流控芯片技术：样本消耗量降至1μL级别
• 人工智能分析：DeepWB系统实现条带自动定量，准确率＞95%
• 单细胞WB：纳升级检测平台解析细胞异质性

名称	货号	规格
WB 4101 hydrochloride	abs814961-25mg	25mg
ECL Select WB Detection Reagent	RPN2235	50ml+50ml
Amersham WB gel card 14 8-18%	29022565	EA
ECL start WB Detection Reagent - 400ml	RPN3244	400ml