Single-cell multiregion dissection of Alzheimer's disease

导读

单细胞核RNA测序技术（snRNA-seq）作为现代医学研究中的前沿工具，以其卓越的分辨率揭示了组织内部的细胞构成。近期，MIT蔡立慧团队与Manolis Kellis团队携手在《Nature》杂志发表了一项突破性研究成果——《Single-cell multiregion dissection of Alzheimer’s disease》。该研究运用snRNA-seq技术，对阿尔茨海默病（AD）患者的多个脑区域进行了全面而深入的剖析，为揭示AD的发病机制提供了崭新的视角。本文将系统阐述snRNA-seq技术的原理及其在AD研究中的具体应用，并进一步探讨其潜在的临床应用价值。

 

研究背景

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）作为一种复杂的神经退行性疾病，全球范围内影响着数百万人的健康与生活。尽管科研界已投入巨资并进行了大量研究，但对其发病机制的深入理解仍显不足。传统的大规模转录组学方法由于分辨率有限，难以捕捉到细胞间的细微差异，而这些差异很可能是揭示疾病本质的关键线索。随着单细胞RNA测序技术（Single-cell RNA Sequencing, scRNA-seq）的兴起，为深入探究AD的发病机制提供了新的契机。

研究设计与结果

在本项研究中，研究人员采用了单细胞核RNA测序（Single-nucleus RNA Sequencing, snRNA-seq）技术，对来自48名参与者的283个大脑样本进行了全面分析。这些样本涵盖了六个不同的脑区，既包括早期受累的区域如内嗅皮层（Entorhinal Cortex, EC），也包括晚期受累的区域如前额叶皮质（Prefrontal Cortex, PFC）。

经过严格的质量控制流程和精细的数据分析，研究人员最终获得了135万个高质量的细胞数据点，这些数据点被进一步分类为14个大类和76个细胞细分亚型。这一详尽的数据集揭示了不同脑区中神经元及胶质细胞亚型的详细分布情况，为理解AD过程中细胞类型的动态变化提供了宝贵的信息。

尤为重要的是，研究发现某些特定类型的抑制性神经元在AD患者中的数量显著减少，这一发现可能与疾病的进展密切相关。这些新见解不仅加深了我们对AD过程中不同脑区细胞类型变化的理解，也为未来的研究和治疗策略提供了新的方向。

 

图1：老年人大脑六个不同区域的snRNA-seq分析

 

研究者利用snRNA-seq技术对6个大脑区域进行了深入分析，这些区域包括在AD早期（I-II阶段）受影响的内嗅皮层（EC）；在AD中期（III-IV期）受影响的海马皮层（HC）和前丘脑（TH）；以及在AD晚期（V-VI阶段）受影响的角回（AG）、颞中皮层（MT）和前额皮质（PFC）。研究发现，神经元比例从TH的14.4%逐渐增加到三层异位皮层HC的32.2%、内嗅边缘皮层的36.6%，直至六层新皮层区域（AG、MT、PFC）的58.9%。相比之下，胶质细胞，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞（OPC）和小胶质细胞/免疫细胞，在新皮层样本中的比例往往较低。

此外，研究还揭示了大脑中兴奋性和抑制性神经元的区域多样性。兴奋性神经元亚型在海马皮层（HC）、内嗅皮层（EC）和前丘脑（TH）中呈现出高度特异性分布，而在新皮层中则存在更多共通的亚型。特别地，丘脑中的主要兴奋性神经元亚型（NXPH1+ RNF220+）并未在新皮层中被观察到。相比之下，大多数抑制性神经元亚型在所有五个皮层区域中均有存在，但某些亚型如PVALB+ HTR4+在新皮质中更为富集，而SST+ NPY+亚型则在EC和HC中更为丰富。此外，研究还在丘脑中发现了一种独特的MEIS2+ FOXP2+抑制性亚型，该亚型表达多种谷氨酸能神经元基因，展现出嵌合特性。

 

图2：基因表达模块注释区域的星形胶质细胞多样性

 

接下来，研究者对各类胶质细胞在大脑不同区域的转录特异性进行了深入检测。在胶质细胞类型中，星形胶质细胞展现出了最高的区域异质性，其中包括了高度新皮层富集型（如GRM3+ DPP10+亚型）和丘脑富集型（如LUZP2+ DCLK1+亚型）。为了验证星形胶质细胞转录的区域特异性，研究者还进行了RNA原位杂交实验。

此外，研究者还创新性地开发了一套名为“单细胞去相关模块网络（scdemon）”的方法。该方法能够识别出高度相关基因的模块，从而有助于发现数量较少的细胞亚群（例如仅占0.7%的小胶质细胞）以及表达量相对较低的基因的功能模块。通过这一方法，研究者发现这种功能模块的表达模式也具有区域和细胞亚型的特异性。例如，在丘脑相关的星形胶质细胞中，就富集了与音猬信号通路相关的基因模块。

 

图3：AD的亚型特异性神经元脆弱性

 

在对不同脑区细胞亚型进行鉴定和特征表达基因研究之后，研究者进一步深入分析了阿尔茨海默病（AD）相关的细胞变化。研究发现，AD导致兴奋性神经元、抑制性神经元和少突胶质细胞前体细胞的数量有所下降，而少突胶质细胞和血管细胞的数量则有所上升，这些变化主要发生在内嗅皮层（EC）、海马皮层（HC）和前额皮质（PFC），尤其在晚期AD患者中更为明显。针对不同区域特异的神经元亚型，多种亚型在AD患者中显著降低。这些AD易损神经元亚型的减少与AD病理以及认知功能下降显著相关，并且在AD患者中呈现出不同脑区协同性降低的现象。

在转录层面，这些易损神经元存在一定的共性，比如它们高表达Reelin通路相关的基因RELN和/或DAB1。RELN通常表达在抑制性神经元中，但也在两种EC易损兴奋性神经元中有所表达，而DAB1的表达在易损兴奋性神经元中则较为普遍。值得注意的是，RELN和DAB1在易损抑制性神经元中的表达也较高，这提示Reelin通路在AD神经元损伤中可能具有普遍且重要的作用。为了验证这一点，研究人员利用阿尔茨海默病小鼠模型进一步验证了Reelin（RELN）阳性兴奋性神经元的易损性。

此外，研究者还对不同病理性AD个体的细胞表达和功能的区域差异进行了分析。结果发现，所有区域的星形胶质细胞、抑制性和兴奋性神经元的差异表达基因数量最高，其中差异最大的脑区为内嗅皮层（EC）。这些发现为深入理解AD的发病机制提供了新的线索和思路。

 

图4：基因表达模块注释和分离AD变化的病理变化

 

神经纤维缠结和淀粉样斑块负荷作为阿尔茨海默病（AD）最重要的病理特征，研究者进一步深入分析了它们对不同脑区各类细胞类型的转录影响是否存在差异。研究发现，神经纤维缠结和淀粉样斑块相关的差异基因存在较高的重叠（如图4a所示），并且这种一致性在内嗅皮层（EC）和海马皮层（HC）中最为显著（如图4b所示）。

尽管二者存在重叠，但它们的差异也十分明显。神经纤维缠结主要影响蛋白质加工、电子传递等细胞基本功能（如图4d所示），而淀粉样斑块则更多地影响免疫、代谢调控等功能（如图4e所示）。为了更深入地了解这些病理特征对各类细胞的具体影响，研究人员进一步提取了神经元和各类胶质细胞的AD病理相关差异表达基因（如图4c、4f-m所示）。

在这些差异表达基因中，伴侣分子、糖酵解和氧化磷酸化相关的基因在多种细胞类型中均有所富集。然而，对于不同的AD病理特征或细胞亚型，具体的差异表达基因会有所不同（如图4l-n所示）。特别值得注意的是，胶质细胞，尤其是星形胶质细胞的糖酵解发生了上调，并且这种变化是随着AD的进展逐渐在不同脑区出现的。这些发现为深入理解AD的病理机制提供了新的视角和线索。

 

图5：CR与AD病理的分子相关性

 

鉴于阿尔茨海默病（AD）患者的认知能力变化并不严格与AD病理的严重程度相关，研究人员因此进一步探究了与认知适应力（CR）相关的各类细胞转录变化，旨在揭示其可能的分子机制。在前额叶皮层细胞中，星形胶质细胞脱颖而出，成为唯一一种在所有认知适应力（CR）和认知衰退适应力（CDR）指标上都具有大量相关基因的细胞类型。

在星形胶质细胞中，一部分与CR相关的基因具有抗氧化活性，其表达水平与认知功能呈正相关，这暗示了抗氧化机制在维护认知功能中的重要作用。此外，还有一部分CR相关的基因与胆碱和多胺代谢密切相关。值得注意的是，这些与CR相关的基因不仅在前额叶区域存在关联，在大脑其他区域的星形胶质细胞中也同样存在，这为开发新型胆碱能/多胺系统靶向的抗AD药物提供了有力的支持。

通过这项研究，对AD进展中不同脑区、不同细胞类型所发生的变化有了更为全面和深入的认识。同时，研究也验证了Reelin通路、糖代谢、胆碱能/多胺系统等作为AD新药开发靶点的潜力，为未来的AD治疗提供了新的思路和方向。

单细胞RNA测序技术在其他科研领域的应用

1. 癌症生物学

单细胞RNA测序技术已在肿瘤微环境的研究中展现了重要作用。通过解析肿瘤内不同细胞类型及其相互作用，科学家们能够更深入地理解癌细胞如何逃避免疫监视、促进血管生成以及转移扩散。例如，一项针对乳腺癌的研究揭示了肿瘤相关巨噬细胞的不同亚群，并阐明了它们在支持肿瘤生长方面的独特功能。这些发现为开发靶向特定细胞群体的免疫疗法提供了有力支持。

2. 发育生物学

在胚胎发育过程中，不同组织器官的形成涉及复杂而有序的细胞分化过程。单细胞RNA测序技术能够追踪这一过程中的基因表达变化，帮助科学家们了解关键调控因子的作用机制。例如，有研究利用该技术绘制了小鼠心脏发育期间的心肌细胞图谱，展示了心肌祖细胞如何逐步成熟为功能性心肌细胞的过程。

3. 免疫学

免疫系统由多种多样的细胞类型构成，每种细胞都有其独特的功能。单细胞RNA测序技术使得研究者能够在单细胞水平上解析免疫应答的动态变化，这对于疫苗开发、过敏反应机制的理解以及自身免疫性疾病的研究至关重要。例如，一项关于流感病毒感染的研究通过单细胞RNA测序揭示了感染后肺部免疫细胞的变化情况，为理解宿主-病毒互作提供了新视角。

4. 神经系统疾病

除了阿尔茨海默病外，单细胞RNA测序技术也被广泛应用于帕金森病、亨廷顿舞蹈症等多种神经系统疾病的探究之中。这种技术可以帮助识别疾病特异性细胞亚型，从而为寻找新的治疗靶点提供线索。例如，有研究表明帕金森病患者的黑质多巴胺能神经元存在异常的基因表达模式，这些信息对于开发针对性药物具有重要意义。

5. 再生医学

单细胞RNA测序技术同样适用于干细胞和再生医学领域。通过监测干细胞分化过程中基因表达的变化，研究者可以更准确地控制细胞命运决定，进而推动组织工程和器官修复技术的发展。最近的研究表明，单细胞RNA测序有助于揭示诱导多能干细胞（iPSCs）重编程过程中关键转录因子的作用机制，这对于实现精准医疗有着深远的影响。

临床应用与展望

对于临床医生而言，通过单细胞RNA测序技术所提供的详细细胞图谱，可以更好地诊断和监测阿尔茨海默病的进展。例如，通过对血液或其他容易获取的生物样本进行类似的单细胞RNA测序分析，未来或许能够开发出非侵入性的生物标志物检测方法。此外，识别那些表现出较强认知韧性的细胞类型也为设计保护性策略提供了线索。长远来看，随着单细胞RNA测序技术成本的降低和技术成熟度的提升，它有望成为常规临床实践中不可或缺的一部分，助力实现精准医疗的目标。

总之，单细胞RNA测序技术不仅在本研究中成功地绘制了一幅详尽的大脑细胞景观图，加深了我们对阿尔茨海默病的认识，还展示了这种先进技术在未来科学研究及临床实践中的广阔前景。