In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution
引言
肿瘤的进化理论提出，在恶性转化发生之前，癌基因中会随机出现驱动突变，这些突变在表型正常的组织中引发克隆扩增现象。尽管克隆扩增能够重塑组织的整体结构，但仅有少数克隆最终会演化为恶性肿瘤，其背后的具体机制尚待阐明。为了深入探究这一问题，7月17日，《Nature》杂志发表了一项题为“In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution”的研究报道。该研究提出了一种创新的体内单细胞CRISPR筛选策略，系统地考察了150种最常见的鳞状细胞癌基因在整个组织中的克隆动态变化。
研究团队巧妙地结合了超声引导的子宫内病毒微注射技术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及导向捕获技术，实现了对克隆扩增的纵向监测，并在单细胞转录组水平上精确记录了其基因表达程序。通过这一策略，研究团队发现了一个依赖于TNF受体1（TNFR1）并涉及巨噬细胞参与的肿瘤坏死因子（TNF）信号模块，该模块在表皮组织中扮演着克隆扩增的重要驱动角色。
然而，在肿瘤发生发展的过程中，TNF信号模块的表达逐渐被下调。相反，研究团队发现了一种具有侵袭性的癌细胞亚群，这些细胞切换到了一个与上皮-间质转化（EMT）密切相关的自分泌TNF基因程序。研究通过体内实验证据进一步证实，自分泌TNF基因程序足以介导癌细胞的侵袭性特性，并且TNF特征与鳞状细胞癌（SCC）患者的较短总体生存期存在显著相关性。
综上所述，这项研究充分展示了体内单细胞CRISPR筛选技术在哺乳动物组织研究中的强大应用潜力，揭示了肿瘤进化过程中不同的TNF程序，并强调了深入理解表皮中克隆扩增与肿瘤发生之间关系的重要性。研究结果不仅为癌症的发生和发展机制提供了新的见解，还为未来针对TNF信号通路开发治疗策略提供了坚实的理论基础。
肿瘤进化理论提出，恶性转化是由癌基因中随机发生的驱动突变所引发的，这些突变进而导致表型正常组织内的克隆性扩增。尽管这些克隆扩增具有重塑整个组织结构的潜力，但最终仅有少数克隆能够演化为恶性肿瘤。因此，深入理解克隆扩增的动态过程及其背后的基因表达程序，对于揭示肿瘤发生的分子机制具有至关重要的意义。为此，本研究开发了一种体内单细胞CRISPR策略，该策略融合了超声引导的子宫内病毒微注射技术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及导向捕获技术，实现了对克隆扩增过程的纵向监测，并在单细胞转录组层面精确记录了其基因表达程序。
研究团队聚焦于150种最常见的鳞状细胞癌相关基因，采用体内单细胞CRISPR筛选策略，深入探究这些基因在表皮组织中的克隆扩增动态。具体实验方法如下：
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构建CRISPR库：精心挑选了150种与鳞状细胞癌密切相关的基因，其中包括134种突变基因和16种拷贝数变异（CNVs），其中15种为扩增型CNVs，构建了全面的CRISPR基因编辑库。
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超声引导的子宫内病毒微注射：将携带CRISPR库的慢病毒精准注射至E9.5小鼠胚胎的羊膜腔内，以特异性感染表达Cas9酶的表皮前体细胞。感染后的细胞将携带特定的sgRNA（单导向RNA），引导Cas9酶进行精准的基因编辑操作。
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单细胞RNA测序（scRNA-seq）：分别在小鼠出生后的第4天（P4）和第60天（P60）收集表皮组织样本，对表达mCherry荧光蛋白的感染细胞进行单细胞RNA测序分析，以全面评估基因表达谱并准确捕获sgRNA的身份信息。
经过严格的实验流程，本研究成功生成了包含477,773个单细胞的RNA测序数据库。通过严谨的过滤步骤和sgRNA注释分析，最终获得了120,077个P4时间点的单细胞和183,084个P60时间点的单细胞数据，平均每个时间点分别覆盖了240个P4细胞和366个P60细胞。为了有效控制双sgRNA感染的情况，感染率被严格控制在1%至12.5%之间，确保了实验数据的准确性和可靠性。
体内单细胞CRISPR筛选策略已被成功应用于小鼠皮肤模型中，实现了对克隆扩增过程的有效监测。具体而言，如图a所示，该策略采用了超声引导的子宫内微注射技术，将包含500个单一导向RNA（sgRNA）的慢病毒库精准注入E9.5小鼠胚胎的羊膜腔内，以确保单层表皮前体细胞的有效感染。图b展示了sgRNA库所针对的目标基因，这些基因涵盖了人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和皮肤鳞状细胞癌（sSCC）中最常见的150个突变基因，其中包括134个突变基因和16个拷贝数变异，为后续的筛选提供了精确的基因靶点。
通过免疫荧光染色技术，图c展示了在P4和P60小鼠皮肤中mCherry阳性克隆的扩增情况，清晰地呈现了表皮中mCherry阳性细胞群的分离状态，进一步验证了筛选策略的有效性。
图d则描绘了P60小鼠皮肤中不同细胞群的位置分布，为理解细胞间的相互作用和克隆动态提供了空间信息。为了更深入地解析细胞群的基因程序和克隆动态，图e展示了通过体内单细胞CRISPR策略识别出的P60小鼠皮肤中的9种细胞群的UMAP（统一流形近似与投影）分析结果。这些细胞群包括表皮干细胞、上基底细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、T细胞和巨噬细胞等，为后续的基因表达分析提供了细胞类型的基础。
图f展示了在所有主要细胞群中均匀检测到sgRNA的UMAP结果，证明了筛选策略在单细胞水平上的广泛适用性。
最后，图g展示了细胞类型特异性标志基因的表达密度图，如Krt10（上基底细胞标志基因）、Krt14（表皮干细胞标志基因）、Cd34（毛囊干细胞标志基因）和Mki67（G2/M期标志基因）等。这些结果不仅确认了细胞类型的准确性，还为深入理解各细胞群的基因程序和克隆动态提供了宝贵的分子证据。
克隆扩增的识别与细胞类型鉴定
通过集成单细胞RNA测序与sgRNA捕获技术，研究团队在小鼠皮肤（P4和P60阶段）中精准识别出了9-10种不同的sgRNA阳性细胞类型。这些细胞类型涵盖了表皮组织中的关键成分，包括表皮干细胞（epidermal stem cells, EpSCs）、上基底细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、T细胞以及巨噬细胞等。利用经典细胞类型标志基因的表达模式，如Krt14（特异性高表达于表皮干细胞）、Krt10（特异性高表达于上基底细胞）和Cd34（特异性高表达于毛囊干细胞），研究团队进一步验证了这些细胞类型的准确性和特异性。
TNF信号模块的发现与功能解析
在深入研究信号传导机制的过程中，研究团队发现了一个独特的肿瘤坏死因子（TNF）信号模块，该模块依赖于TNF受体1（TNFR1）并涉及巨噬细胞的参与。这一信号模块在表皮组织中扮演着克隆扩增的一般驱动因素的角色，表明其在维持表皮稳态和细胞增殖中的重要作用。然而，在肿瘤发生的过程中，TNF信号模块的表达被显著下调，提示其在肿瘤抑制或逃逸机制中可能发挥的作用。
与此相反，研究团队还发现了一种侵袭性癌细胞的亚群，这些细胞在肿瘤进展过程中切换到了一个与上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）密切相关的自分泌TNF基因程序。这一发现揭示了癌细胞在适应肿瘤微环境和增强侵袭性方面的一种新策略。
基因程序分析与TNF信号富集
为了更深入地理解细胞群的基因表达模式和克隆扩增的分子机制，研究团队利用单细胞RNA测序数据进行了加权基因相关网络分析（WGCNA）。通过这一分析，他们成功地在P60小鼠皮肤细胞群中识别出了44个基因模块。其中，一个主要基因模块在6个细胞群中占据主导地位，包含了25个基因，并显著富集了TNF信号通路的相关基因。进一步的分析显示，高表达TNF基因模块的克隆扩增率显著较高，这有力地支持了TNF信号模块在克隆扩增过程中的关键作用。
克隆扩增与肿瘤发生的关联研究
为了进一步验证TNF信号模块在肿瘤进化中的功能作用，研究团队设计并实施了一系列实验。实验结果表明，TNFR1依赖性和巨噬细胞消耗的数据为TNF信号模块在正常表皮中克隆扩增的功能提供了强有力的实验证据。此外，研究还发现，在克隆扩增向肿瘤发生的转变过程中，癌细胞会策略性地下调用于克隆扩增的TNF模块，并转而激活自分泌TNF-MMP9和MMP10轴。这一转换不仅促进了癌细胞的侵袭性，还加速了侵袭性肿瘤的形成过程。这些发现为理解肿瘤发生和发展的分子机制提供了新的视角和线索。
上皮细胞中TNF表达对肿瘤细胞侵袭和转移的影响:研究表明，上皮细胞中的肿瘤坏死因子（TNF）表达不仅具有诱导细胞侵袭特性的能力，还通过自分泌途径激活基质金属蛋白酶（MMP）基因的表达，进而促进肿瘤细胞的侵袭和转移过程（Credit: Nature）。
实验设计与TNF表达构建的验证:图a展示了用于验证上皮TNF诱导侵袭特性的实验设计框架。研究团队精心构建了一个携带TNF表达构建体的慢病毒载体，并将其注射到E9.5阶段的小鼠胚胎中，以观察TNF表达在P60阶段对皮肤细胞的影响。这一设计旨在模拟体内TNF过表达的环境，并评估其对细胞行为的长远影响。
TNF蛋白表达验证:图b通过免疫印迹（Western blot）技术，展示了在不同基因敲除背景下TNF蛋白的表达情况。这一验证步骤确保了TNF表达构建体的有效性和特异性，为后续的实验提供了可靠的基础。
TNF诱导侵袭特性的实验验证:图c详细展示了TNF诱导侵袭特性的实验结果。通过流式细胞术（FACS）和免疫荧光染色技术，研究团队观察到，在表达TNF的小鼠皮肤细胞中，侵袭性标志基因（如Mmp9和Mmp10）的表达水平显著增加。这一发现直接支持了TNF在诱导细胞侵袭特性中的关键作用。
侵袭性细胞比例的变化:图d展示了在表达TNF的小鼠皮肤细胞中，侵袭性细胞所占比例的变化情况。结果表明，TNF表达显著增加了皮肤中侵袭性细胞的比例，进一步证实了TNF在促进细胞侵袭和转移中的重要作用。
空间转录组学分析:图e利用Visium空间转录组学技术，对肿瘤细胞的空间分布和基因表达情况进行了深入分析。结果显示，表达Mmp10的侵袭性肿瘤细胞主要分布在肿瘤的侵袭前沿，并与基底膜标志基因（如β4-integrin）存在共定位现象。这一发现揭示了侵袭性肿瘤细胞在空间上的分布规律及其与基底膜的相互作用。
细胞共现分析:图f展示了细胞共现分析的结果，表明表达Mmp10的侵袭性肿瘤细胞与纤维细胞和内皮细胞共存，形成了一个与纤维血管相关的生态位。这一发现揭示了肿瘤细胞与微环境细胞之间的相互作用关系，为理解肿瘤细胞的侵袭和转移机制提供了新的视角。
肿瘤细胞的选育分析:图g展示了对不同sgRNA突变体在肿瘤中选育情况的分析结果。结果表明，某些基因突变（如Zmat3、Prkdc、Myh8等）在肿瘤细胞中的表达显著增加，提示这些基因突变可能与肿瘤细胞的侵袭特性密切相关。这一发现为筛选和鉴定与肿瘤侵袭相关的基因提供了有力的证据。
基因表达谱对比分析:图h展示了正向选择和负向选择突变体在P60阶段的基因表达谱对比分析结果。结果显示，正向选择突变体中上皮-间质转化（EMT）相关基因显著富集，进一步支持了TNF在诱导细胞侵袭和转移过程中通过激活EMT相关基因的作用机制。这一发现为理解TNF在肿瘤进展中的复杂作用提供了新的见解。
既往研究表明，驱动突变在正常人类上皮组织，诸如皮肤、食管及结肠中，以惊人的高频率存在。这些研究成果揭示了一个重要现象：具有高竞争力的驱动突变克隆能够通过克隆竞争机制消除新兴的肿瘤细胞，从而发挥出抑制肿瘤的作用。这一观察结果不仅深化了我们对上皮组织克隆动态的理解，还进一步凸显了深入探究正常上皮中的克隆扩增过程及其在驱动恶性转化中所扮演角色的必要性。
然而，传统的CRISPR筛选方法往往受限于其提供结果的单一性，如仅能反映细胞增殖情况，而难以全面剖析基因扰动在所有细胞类型中的转录组后果。为了克服这一局限性，本研究创新性地结合了超声引导的子宫内病毒微注射技术、单细胞RNA测序技术以及导向捕获技术，构建了一套全面的基因功能分析体系。这一体系的应用，使得我们能够对正常上皮及肿瘤发生过程中的基因功能进行更为深入和全面的了解。
综上所述，本研究通过体内单细胞CRISPR筛选策略的创新应用，成功揭示了肿瘤进化过程中存在的不同TNF信号程序。同时，研究还强调了深入理解表皮中克隆扩增与肿瘤发生之间关系的重要性。研究结果不仅为癌症的发生和发展机制提供了新的见解，还为未来针对TNF信号通路开发治疗策略提供了坚实的理论基础。通过对研究方法、结果及观点的深入分析和拓展，我们有望更全面地把握这项研究的意义，以及其对未来癌症研究和治疗的潜在影响。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | 69506 | 250Test |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | 69504 | 50Test |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 5 | P36961 | 5x2mL |
| Ms CD104 Pure 346-11A 500ug | 553745 | 500ug |
