Mitochondrial complex I activity in microglia sustains neuroinflammation
以下是一个学术性的表达，用于介绍这篇刊登在《Nature》（IF=64.8 一区）上的文章：“Mitochondrial complex I activity in microglia sustains neuroinflammation”：“研究揭示：小胶质细胞中线粒体复合物I的活性成为中枢神经系统慢性炎症性疾病神经保护潜力的新治疗靶点”。
研究背景
在多发性硬化症（MS）中，存在一类以病变边缘骨髓细胞积聚为显著特征的慢性活动性、缓慢扩张的闷烧性病变，这些病变与脑萎缩密切相关，并且是预测不可逆残疾积累及推动疾病进展的重要因素。此类病变中，髓系细胞持续活化，成为神经毒性因子的持续释放源，这些因子包括肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1β（IL-1β）、一氧化氮（NO）以及活性氧（ROS），它们共同作用导致髓鞘再生受阻和继发性神经元/轴突损伤。在多发性硬化症样疾病模型中，轴突损伤后会引发一种代偿反应，即脱髓鞘轴突中的线粒体含量和活性增加，以发挥神经保护作用。然而，神经元线粒体复合物功能受损及能量代谢缺陷则与持续的轴突损伤、灰质萎缩以及多发性硬化症的疾病进展紧密相关。
研究表明，线粒体呼吸复合物及代谢物对骨髓免疫反应具有调控作用。先前的体外实验揭示，在炎症环境下，髓系细胞内琥珀酸水平上升，会促使呼吸链中的电子传递方式从正常的正向传递转变为通过线粒体复合物I（CI）的反向电子传递（RET）。此过程需依赖高质子动力，导致线粒体功能从三磷酸腺苷（ATP）生成转向超氧化物产生，进而生成过氧化氢及其他活性氧物种（统称为线粒体ROS，mtROS）。
可逆抑制剂衣康酸或丙二酸能够抑制琥珀酸脱氢酶（亦称作线粒体复合物II，CII）的活性，从而有效限制反向电子传递（RET）诱导的线粒体活性氧（mtROS）产生，并在体外实验中促进髓系细胞发挥抗炎作用。类似地，阻断CII或线粒体复合物I（CI）的活性，可以防止体内梗死心脏在再灌注过程中由RET介导的mtROS损伤。然而，在线粒体复合物参与慢性、低度炎症性中枢神经系统（CNS）疾病的过程中，它们如何持续促进小胶质细胞的活化，这一机制尚待深入探索。
主要研究发现
在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间，小胶质细胞显示出线粒体复合物I（CI）表达的上调。为了深入探究小胶质细胞与中枢神经系统浸润髓样细胞在维持中枢神经系统炎症中的分子合作机制，本研究采用了基于体外单细胞RNA测序（scRNA-seq）和液相色谱-质谱（LC-MS）技术的Cx3cr1-YFP分析creERT2型R26型td番茄命运映射小鼠模型，并通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35–55）诱导EAE。scRNA-seq数据揭示，在A-EAE小鼠中，浸润性髓系细胞占据主导地位，而对照组和C-EAE小鼠中则以小胶质细胞为主（见图1a），这进一步支持了小胶质细胞存在差异性的细胞转录状态。具体而言，A-EAE小鼠中hMG样细胞的比例显著下降至所有分离细胞的不到1%，而在C-EAE小鼠中则增加至36%，这表明在疾病的慢性阶段，体内平衡得到了一定程度的恢复。此外，本研究的方法还鉴定出了几个疾病相关小胶质细胞（DAM）集群（即集群3、4、5、7、8和10），这些集群在对照组小鼠中几乎不存在，在A-EAE小鼠中有所增加，并在C-EAE小鼠中持续存在（分别占所有分离细胞的8%、46%和48%）（见图1b）。
图1
鉴于持续性疾病相关小胶质细胞（DAM）活性在慢性中枢神经系统疾病中的潜在致病作用，研究对小胶质细胞进行了聚类分析，以深入探究其在病程中的活化特征和动态变化。随后，研究分析了不同细胞及小胶质细胞集群中RNA表达变化的速度和方向性（图1c）。在所有DAM簇中，DAM簇4是唯一一个从对照组到急性EAE（A-EAE）再到慢性EAE（C-EAE）持续增加的簇（分别占DAM的6%、23%和29%），并且它显示出向其他小胶质细胞簇转变的概率最低，提示其在EAE中的持续状态。在转录方面，DAM簇4的特征是DAM基因表达增加，包括Spp1、Cd63、Cst7、Timp2和Apoe等（图1d）。研究对DAM簇4进行了额外的转录组学和亚聚类分析，以确定驱动其在EAE中持续存在的假定机制。研究发现，DAM簇4进一步表征了与糖酵解（例如Gapdh和Aldoa）和氧化磷酸化（例如Cox4i1和Ndufa1）相关的差异表达基因（DEG），而子聚类分析确定了三个主要的子簇（图1e）。DAM子簇4.1和4.3的GO项分析显示，参与髓系活化和代谢物信号传导的几种通路富集（图1f）。相反，DAM子簇4.2的特征是与电子传递链、线粒体复合物I（CI）功能（NADH到泛醌）和针对电化学梯度的能量耦合质子传递相关的途径。鉴于CI和复合物II（CII）在促炎性髓系细胞中电子传递和活性氧（ROS）生成中的已知功能作用，研究进一步分析了编码这两种线粒体复合物的基因。发现与表达氧化应激标志物GP91-PHOX的SPP1RFPYFP在C-EAE小鼠中小胶质细胞的显著增加有关。
为了探究这些小鼠数据与人类疾病的相关性，研究重新分析了两个独立的公开可用的单核RNA-seq数据集，这些数据集来自多发性硬化症（MS）患者和对照组的尸检。因此，研究确定了一组持续激活的DAM，这些DAM具有高表达的CI基因和蛋白质，它们在小鼠的C-EAE期间持续存在，并且几乎只在进行性MS患者的慢性活动性病变（CAL）边缘发现。为了进一步了解维持慢性中枢神经系统炎症的小胶质细胞和浸润性髓样细胞的代谢特征，研究接下来对体外分离的髓样细胞的细胞内代谢组进行了LC-MS分析。脊髓切片的激光解吸-快速蒸发电离质谱（LD-REIMS）分析证实，衣康酸盐和抗坏血酸在原位白质炎症浸润中的丰度更高。对整个LC-MS数据集的分析显示，衣康酸水平与抗坏血酸以及脱氢抗坏血酸之间存在直接相关性（图2c-e）。
图 2
为了将代谢变化与scRNA-seq数据集中相关基因的表达联系起来，研究聚焦于从对照组和EAE小鼠中分离出的小胶质细胞簇。通过对scRNA-seq数据集的重新分析，研究发现正向调节线粒体自噬的基因在35C-EAE（此处可能指特定时间点或条件下的EAE小鼠）与A-EAE小胶质细胞中表达减少。这表明基因调控网络在DAM簇4中下调了线粒体自噬，而上调了引导CI（线粒体复合物I）转录的基因调控网络。为了将这些代谢和转录特征与线粒体复合物的功能相联系，研究在疾病的不同阶段进行了离体代谢通量分析，结果显示，与对照组和A-EAE小胶质细胞相比，C-EAE小胶质细胞的CI和CII（线粒体复合物II）活性水平显著更高（图2j）。
为了进一步探究线粒体CI是否通过反向电子传递（RET）作用来放大持续性闷烧样炎症性中枢神经系统疾病中的氧化应激，研究将RET诱导的体外模型应用于促炎小鼠小胶质细胞。数据表明，CI在体外RET期间作为促炎小胶质细胞中线粒体活性氧（mtROS）产生的关键枢纽。为了测试RET促炎啮齿动物小胶质细胞的致病作用，研究使用避免细胞间接触的transwell共培养系统将它们与SH-SY5Y神经元细胞共培养，证实了ROS在小胶质细胞神经毒性中的主导作用。
研究还进一步验证了从小鼠小胶质细胞获得的人诱导多能干细胞（iPS）细胞衍生诱导小胶质细胞（hiMGs）的主要发现。与对照组相比，RET促炎性hiMGs在SH-SY5Y细胞中产生显著更多的mtROS，线粒体膜电位增加，并导致神经突毒性增强。与小鼠小胶质细胞的结果一致，这些作用均可通过鱼藤酮治疗在hiMG中抑制CI来阻止。因此，通过抑制CI阻断促炎啮齿动物和人小胶质细胞中的RET，可以在体外防止过度的mtROS相关神经毒性。
为了进一步确定CI和RET在小胶质细胞极化和功能中的作用，研究从携带线粒体CI基因Nd6中点突变的小鼠（Nd6小鼠）中分离出原代小胶质细胞。该突变阻断RET，同时保持正常的正向电子传递。用LPS和IFNγ刺激小胶质细胞后，野生型（WT）和Nd6小胶质细胞中编码主要促炎细胞因子的基因表达均有所增加，但刺激的Nd6小胶质细胞显示出显著更高的线粒体ATP产生。Nd6小胶质细胞没有增加mtROS的产生（图3b），或在与SH-SY5Y细胞共培养时引起显著的神经突毒性（图3c），即使在体外条件下迫使它们进行RET。
图3
为了验证这些发现在体内疾病模型中的相关性，研究诱导了MOG35–55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）在Nd6和野生型（WT）小鼠中。结果发现，参与抗原加工和呈递的溶酶体基因表达增加，例如Ifi30和Ctss，但没有观察到与生长因子活性相关的显著差异表达基因（DEG）。接下来，研究从非免疫对照和EAE小鼠中分离出CD45+Cd11b+髓样细胞，以评估其线粒体膜电位（图3h）。在未免疫的对照小鼠中，Nd6组和WT组之间的线粒体膜电位没有显著差异。然而，在EAE模型中，与WT小鼠相比，从Nd6小鼠中分离的髓样细胞具有显著降低的线粒体膜电位。这表明，Nd6小鼠中反向电子传递（RET）的缺乏积极调节了小胶质细胞对神经炎症的反应，从而导致体内氧化应激的减少。
为了进一步研究仅在急性EAE（A-EAE）和慢性EAE（C-EAE）之间的过渡期间治疗靶向髓样细胞中线粒体复合物I（CI）的可能性，研究构建了Ndufs4敲除（Ndufs4-KO）小鼠。研究发现，与Ndufs4野生型（Ndufs4-WT）EAE小鼠相比，Ndufs4-KO EAE小鼠在达到C-EAE阶段时的疾病严重程度显著降低。在未免疫的对照小鼠中，Ndufs4-KO小鼠在簇3少突胶质细胞中略有减少（1.1倍），而在簇0小胶质细胞中增加（2.6倍），这些细胞的特征在于参与细胞骨架组织的基因表达，如β肌动蛋白（Actb）和胸腺素β-4（Tmsb4x）（图4b）。这与研究之前的scRNA-seq数据集中发现的调节细胞骨架组织的基因差异相一致。
因此，研究结果表明，在体内靶向髓系细胞中的CI活性可以增加人类诱导小胶质细胞样细胞（hMG样细胞）并诱导疾病相关小胶质细胞（DAM）的变化，从而共同防止氧化应激和相关的神经毒性。
图4
接下来，该研究在小鼠和人类小胶质细胞中进行了体外药物筛选测试，旨在选择针对线粒体复合物I（CI）和线粒体复合物II（CII）活性的抑制剂，以便进行后续的体内测试。在体外实验中，CI抑制剂鱼藤酮和二甲双胍，以及CII抑制剂丙二酸二甲酯（DMM）和丙二酸二钠，被证明在减少线粒体活性氧（mtROS）产生方面效果最为显著。当使用选定的CI和CII抑制剂进行组合治疗时，这种减少mtROS的效果得到了进一步增强。
研究结论
尽管线粒体在多发性硬化症（MS）中的神经元作用已被广泛研究，但该研究揭示了一种关键的线粒体机制，该机制通过维持小胶质细胞的持续激活和神经毒性损伤，进而促进中枢神经系统炎症的延续。从机制层面来看，该研究表明，通过使用小分子药物阻断CI或使用缺乏反向电子传递（RET）能力的Nd6小胶质细胞，可以在体外有效阻止这一过程。在体内动物疾病模型中，干扰线粒体CI亚基的功能能够促进保护性人类诱导小胶质细胞样（hMG样）表型的获得。这一发现为靶向治疗和缓解长期中枢神经系统炎症提供了一条有前景的途径。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | 7074P2 | 100ul |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | 7074S | 1ml |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | 7076P2 | 100ul |
| Transcription Factor Buffer Set | 562574 | 100Tst |
