细胞ATP发光检测攻略

检测原理

2D Luminescent Cell Viability Assay 借助 ATP 依赖的荧光素酶催化的荧光素发光反应，通过化学发光信号测定细胞内 ATP 含量，从而检测细胞活力或定量检测活细胞数目，检测线性范围宽、灵敏度高、稳定性好。96 孔板中，在 100 个至 100,000 个细胞范围内有良好的线性关系，但不同细胞的检测数量上限会有不同。此外，操作简单，试剂盒中提供的检测试剂为即用型，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约 10 分钟，无需洗涤细胞，也无需更换或去除培养液。相比于其他常见的细胞活力测定方法，如 Calcein-AT、CCK-8 等，2D Luminescent Cell Viability Assay 更加简单快捷。 

产品优势

2D Luminescent Cell Viability Assay (abs50065)检测灵敏度高、线性范围宽，可兼容少量样品检测以及大量样品的高通量筛选。 

1、方便快速：试剂盒中提供的检测试剂为即用型，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约 10 分钟； 
2、灵敏度高：能够检测最低 10nmol 的ATP； 
3、线性范围宽：96 孔板中，在 100 个至 100,000 个细胞范围内有良好的线性关系，但不同细胞的检测数量上限会有不同； 
4、高通量：可兼容少量样品检测以及大量样品的高通量筛选。

使用方法

一、试剂准备

试剂融化：实验前一天将试剂取出，置于 4℃过夜融化。也可在实验当天将试剂取出，置于室温融化，或放置于 22℃水浴融化，但需要注意水温不可超过 25℃。

平衡至室温：若试剂在非室温条件下融化，使用前可将其置于 22℃水浴，确保试剂平衡至室温后再用于检测。
注：一般针对 5mL 包装需要约 10min；50mL 包装需要约 20min。
混匀：使用前轻柔颠倒 5 次使溶液混合均匀。
添加Triton X-100（abs9149）：吸取当次实验所需体积的试剂，加入适量体积Triton X-100，使其终浓度为0.2%。该液体为检测工作液（例如：99.8mLATP检测试剂加0.2mL Triton X-100）。

二、检测步骤

1、细胞培养
使用适合进行化学发光检测的96孔板（abs7149），每孔接种100μL细胞（根据培养时间确定初始接种的细胞密度，检测时每孔细胞数量不宜超过10万个），同时设置不含细胞的培养液的孔作为阴性对照。也可以设置细胞的浓度梯度，以得到最佳的实验结果。37℃，5% CO2培养细胞，根据需要在合适的时间加药处理细胞。

2、（可选）ATP 标准曲线的制作
把制备的 ATP 标准溶液用PBS稀释成适当的浓度梯度，96孔板每孔加入100μL的标准品。

3、细胞活力检测
（1）融解冻存的发光法检测试剂，并平衡至室温（或22℃恒温水浴平衡），并取出当次实验用体积的检测试剂，添加适量Triton X-100（使其终浓度为0.2%）
（2）取出细胞培养板，室温平衡10分钟（或22℃恒温平衡，时间不宜过长，尽量控制在30分钟以内）
（3）96孔板每孔加入100μL检测试剂（由于孔的边缘效应，可能会导致发光信号不稳定，不建议在边缘铺板）
（4）室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解；
（5）室温放置10分钟，使发光信号趋于稳定；
（6）使用多功能酶标仪进行化学发光检测。根据仪器要求设置相应的参数，每孔的检测时间一般为0.25-1s，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整；
（7）根据化学发光读数计算细胞的相对活力，或根据ATP标准曲线计算ATP含量从而得出细胞的相对活力。
注：检测效果因细胞的种类不同而异，对于一些ATP含量特别高的细胞，在细胞数量达到 100,000以上可能会出现化学发光读数继续升高，但丧失线性关系。

三、注意事项

1、温度：试剂中含有荧光素酶，反复冻融会影响其活性。建议分装后置于-20℃避光保存。试剂及细胞样品使用前均需平衡至室温，以避免酶催化效果的影响；
2、化学因素：荧光素酶的反应速率和发光强度受化学环境影响。不同类型的培养基和血清中发光强度和衰减速率存在差异。另外，药物含量较高时可能会干扰荧光素酶反应，从而影响发光信号。建议设置含有药物的细胞培养液对照孔以排除溶剂的干扰。如培养基对发光强度影响较大，可在检测前去除，并用PBS润洗一次，此时，Triton X-100添加量减半，至终浓度0.1%即可；
3、光敏感：本试剂对光敏感，如果储存时暴露在光照下，会加快发光强度的衰减。如果试剂从原来的容器转移，请确保避光保存；
4、ATP 污染：建议操作时佩戴口罩和乳胶手套，避免接触可能受到污染的表面和设备。操作时避免多次将枪头尖端插入试剂瓶中。

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