重组酶聚合酶扩增技术（RPA）的原理与应用

重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）是一项由Piepenburg等人于2006年开创的核酸扩增技术，该技术巧妙地利用了参与细胞DNA合成过程中的蛋白重组与修复机制。与依赖复杂仪器进行循环扩增的传统聚合酶链式反应（PCR）不同，RPA在温和的温度范围（37-42°C）内即可操作，且仅需极少的样本预处理步骤。其能够在短短10分钟内有效扩增低至1-10个拷贝的DNA，展现出卓越的高灵敏度、高度的可选择性、良好的便携性、快速的反应速度以及多重扩增的能力。目前，RPA技术已被广泛应用于多种不同靶标的扩增，涵盖了RNA、微小RNA（miRNA）、单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）等领域。上述特性使得RPA成为一种功能强大且应用广泛的核酸扩增手段。

RPA工作原理

RPA（重组酶聚合酶扩增）的工作原理基于重组酶与寡核苷酸引物结合形成蛋白-DNA复合物的能力，该复合物能在双链DNA中精准地识别并定位同源序列。一旦同源序列被定位，随即触发链置换反应，进而引发DNA合成过程，实现对模板上靶标的指数级扩增。在此过程中，单链DNA结合蛋白（SSB）扮演着关键角色，它与被置换的DNA链结合，稳定形成的D环结构，有效防止了进一步的链替换事件。整个RPA扩增反应极为迅速，即便起始材料仅为几个目标DNA拷贝，也能在极短的时间内（几分钟内）达到可检测的水平。RPA体系的核心包含三种至关重要的酶/蛋白组件：与引物特异性结合的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB），以及执行链置换功能的DNA聚合酶。

RPA技术的优点

操作简便且快速：在最优反应温度37-42°C下，仅需少量模板DNA或RNA，RPA即可在3至10分钟内将其扩增至可检测水平。多数情况下，非专业人员也能够在半小时内完成从样本采集、准备到实验检测并获取结果的整个过程。

高度灵敏：RPA技术能够检测复杂样本中的单拷贝DNA以及低于10个拷贝的RNA，且无需预先进行核酸纯化步骤。

高度特异：RPA具备在复杂基因组中检测和扩增来自多个不同物种的单个DNA分子的能力。

恒温扩增特性：RPA无需通过温度循环来实现变性、复性和延伸的扩增过程，其在常温37-42°C条件下即可反应，甚至在25°C条件下也能在一个小时内获得扩增结果。

广泛的样本包容性：RPA技术能够处理多种类型的样本，包括直接处理复杂的样本如未经核酸纯化的血液或鼻拭子，仅需通过热或碱预处理以促进核酸释放。

广泛的适用性：RPA已广泛应用于多种不同靶标的扩增，涵盖RNA、微小RNA（miRNA）、单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）等。

多重扩增能力：RPA允许在同一反应管中加入多个引物，以同时检测多个靶标。

成本效益：由于RPA在恒温条件下反应且操作简单，因此可以降低用户的仪器成本。

RPA（重组酶聚合酶扩增）引物设计

引物长度：RPA引物的标准长度通常设定为30至35个核苷酸（nt）。值得注意的是，已有文献报道常规PCR引物同样适用于RPA反应。引物长度若过短，可能会影响重组酶的活性；虽然长度为45 nt的引物也可使用，但会增加形成二级结构的可能性。

引物序列设计原则：
1）在引物的5’末端，应避免连续出现鸟嘌呤（G），而胞嘧啶（C）则是一个优选，因其有助于促进DNA片段的重组；
2）引物的3’末端最好是鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）组合，这有助于提高扩增效率；
3）引物的GC含量应控制在30%至70%的范围内，以确保适宜的扩增性能；
4）在设计引物时，应尽量避免选择那些易于形成二级结构或发夹结构的序列，以减少引物二聚体的生成。

扩增长度：RPA技术能够扩增长度达到1.5千碱基（kb）的DNA产物，然而，对于长度为100至200碱基对（bp）的扩增子，其扩增效果最为理想。此外，若需使用检测探针，则在设计扩增引物时，应预留足够的空间以供探针结合。