甲基转移酶
PMT概述
蛋白甲基转移酶（Protein Methyltransferases, PMT）作为表观遗传学研究的关键分支，深刻参与细胞命运的表观遗传调控，并广泛涉及肿瘤发生、进展及侵袭等多个生物学过程的信号通路。PMT依赖于辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM），催化甲基基团转移至细胞内或细胞核内蛋白质的赖氨酸（Lys）或精氨酸（Arg）残基侧链，这一过程对蛋白质功能及细胞活动具有深远影响。
迄今为止，已在超过2400种蛋白质中观察到甲基化修饰，其中组蛋白甲基化尤为引人注目，其在染色质介导的信号传导及细胞命运决策中占据核心地位。研究表明，甲基化状态的失衡与癌症、神经退行性疾病等多种病理状态高度相关，提示PMT相关通路成员是药物研发极具潜力的靶点。
图1: Chemical Coverage of PMTs
人体中已鉴定出50种含有SET结构域的赖氨酸甲基转移酶以及13种具有Rossman折叠的赖氨酸或精氨酸甲基化酶（如图1所示）。自2007年首例PMT抑制剂的发现以来，针对该酶家族活性抑制剂的研究取得了显著进展，至今已发现7种赖氨酸甲基化酶（PKMT）及3种精氨酸甲基化酶（PRMT）抑制剂。值得注意的是，甲基化酶通常包含多个结构域，赋予其多样化的功能特性。以人体MLL蛋白为例，该蛋白不仅包含对组蛋白H3K4甲基化至关重要的SET结构域，还编码有识别乙酰化赖氨酸的BRD结构域、结合甲基化侧链的PHD结构域及识别甲基化CpG岛的CXXC结构域（如图2所示），针对不同结构域的靶向干预可产生截然不同的生理效应。
此外，PMT常作为大型多蛋白功能复合体的组成部分，这一特性增加了其功能研究的复杂性，但同时也为药物研发提供了多元化的靶向策略。综上所述，PMT作为表观遗传调控的核心机制，在维持正常生理功能及疾病发生发展中扮演关键角色，对其深入研究不仅有助于揭示生命活动的奥秘，更为疾病的预防、诊断及治疗开辟了新的途径。
图2: Multimodular Nature of PMTs
PMT抑制剂设计：针对底物及辅因子结合位点的策略与挑战
在蛋白甲基转移酶（PMT）的催化过程中，作为甲基供体的辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）与接受甲基的底物分别结合于PMT分子的不同位点（见图3A），两者通过一条狭窄的通道相连，此通道正是甲基转移反应发生的场所（见图3B）。针对这两个关键位点的赖氨酸甲基转移酶（PKMT）抑制剂已有相关报道。
通常，底物结合位点相对深邃且构成一个封闭的空间，从结构特征上推测，这种构象有利于小分子抑制剂类药物的设计与开发。事实上，绝大多数PMT抑制剂确实属于底物类型的抑制分子。由于不同的酶能够识别并结合特定的底物，这导致了PMT中底物结合位点结构的多样性。此外，针对同一种底物的不同酶，其抑制剂同样可以展现出选择性。例如，UNC0638能够抑制针对组蛋白H3K9的甲基转移酶G9a和GLP，但对SUV39H1及SUM39H2则无抑制作用。
SAM作为所有PMT的共同辅因子，但其与PMT结合的氨基酸残基保守性却极低，这一区域的结构多样性堪比蛋白激酶中的ATP结合位点。对于药物研发而言，SAM结合位点面临的主要挑战在于其高度的亲水性。由于SAM分子本身具有极强的极性，因此所开发的小分子抑制剂必须同时具备足够的极性和疏水性，以便既能占据SAM结合位点，又能穿越细胞膜系统，这一要求在化学设计上极为困难。
图3：Structural Mechanism of Cofactorand Substrate Competitors
然而，令人惊讶的是，迄今为止进入临床试验阶段的PMT抑制剂均为辅因子竞争类型，分别是针对组蛋白H3K79甲基转移酶DOT1L和H3K27甲基转移酶EZH2的抑制剂，这两者的功能异常分别与白血病和淋巴癌相关。结构生物学研究表明，这两类抑制剂采用了不同的策略来克服SAM结合位点的亲水性挑战。针对EZH2的抑制剂一侧结合在EZH2与EED之间的疏水相互作用面上，而另一侧虽然只有很小一部分与SAM结合口袋相重合，但已足以实现对SAM结合位点的抑制（见图3D）。而针对DOT1L的抑制剂则通过改变SAM结合位点附近的微环境，实现与其紧密结合（见图3E）。
尽管辅因子竞争类型的抑制剂率先进入了临床试验阶段，但它们采用的是“迂回策略”以克服辅因子结合位点的亲水性难题。相比之下，底物结合口袋区域在药物设计与开发方面更具优势，其作用模式也更为直接。
辅因子依赖性底物竞争抑制剂的机制探究
在Barsyte和Chan对SETD7及PRMT5潜在底物竞争性抑制剂的研究中，他们观察到一个有趣的现象：当缺乏辅因子时，这些抑制剂无法有效结合到相应的靶蛋白上。这一观察结果引发了一个直观的推测，即辅因子的存在对于底物结合区域的形成及其稳定性至关重要。进一步深入的结构分析揭示，这些抑制剂不仅与靶蛋白的底物结合区域发生相互作用，还直接参与了与辅因子SAM的结合。
Chan等人的研究进一步发现，破坏抑制剂与辅因子SAM之间的相互作用会显著减弱抑制剂与PMT之间的结合强度。结合对其他类型PMT及相应晶体结构的深入分析，辅因子SAM中甲基基团的重要性逐渐得到凸显。甲基基团不仅能够作为氢键的供体增强相互作用力，还为相应的药物设计及合理优化提供了一个全新的视角和潜在的靶点。这些发现不仅加深了我们对辅因子依赖性底物竞争抑制剂作用机制的理解，也为开发针对PMT的新型抑制剂提供了有价值的理论依据和实践指导。
图4: Structural Chemistryof Substrate Competitors
针对PRMT抑制剂的片段筛选与别构抑制剂设计
在针对蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）抑制剂的片段筛选过程中，传统观点认为，抑制剂分子骨架片段由于其尺寸较小，通常难以诱导或稳定蛋白质中的构象变化，从而难以达到预期的药效。鉴于绝大多数蛋白甲基转移酶（PMT）活性位点附近结构的动态特性，片段筛选在PMT抑制剂类药物筛选中似乎面临严峻挑战。一项概念验证试验表明，当片段从母体化合物中分离出来后，无法有效抑制相应的蛋白赖氨酸甲基转移酶（PKMT）活性（见图4D）。尽管在G9a的特定案例中，容纳甲基化赖氨酸的口袋区域在配体缺失的情况下已经预先形成，但这一观察结果并未改变片段筛选在PMT抑制剂开发中的普遍困境。
然而，凡事总有例外。Ferreira在研究一个IC50值为300nM的抑制剂片段时，发现该片段能够占据甲基化精氨酸的结合区域，尽管这一区域在缺乏配体时并未完全形成。结构分析揭示，该片段末端的氨基可与催化活性中心的谷氨酸形成稳定的静电相互作用。值得注意的是，该氨基酸残基在PRMT家族中具有高度保守性，提示其可作为相互作用的热点，用于对带有正电荷的抑制剂片段库进行活性筛选，这为片段筛选在PRMT抑制剂开发中的应用提供了新的视角。
另一方面，PMT家族底物结合位点的独特结构可变性对抑制剂的从头设计策略构成了极大挑战，迄今为止成功案例极为罕见。然而，PMT多亚基的存在为别构抑制剂的设计提供了潜在机会。在对DOT1L抑制剂的研究中，发现抑制剂能够占据辅因子结合位点旁的空间，影响甲基转移反应活性中心区域“loop”的构象，使其处于活性未完全激活的状态（见图3）。这一发现为别构抑制剂的设计提供了重要启示。
别构抑制剂的一个典型案例来自PRMT3。与绝大多数PRMT家族成员相似，PRMT3由一个Rossman折叠、一个β桶状区域及一段负责形成同源二聚体的α螺旋构成。在复合体结构中，抑制剂SGC707结合在β桶状区域与二聚化α螺旋臂形成的沟槽内，与催化活性位点相距约10Å。在抑制剂存在的情况下，蛋白N端一段有助于底物结合的α螺旋变得无序。一个可能的解释是，抑制剂的存在改变了催化活性中心周围的微环境，从而阻止了活性构象的形成。这一推测已在生化实验中得到了证实。
另一个案例来自PRMT6。在复合体结构中，抑制剂结合位点与辅因子及底物结合位点的距离超过10Å。抑制剂通过一种未知方式改变了N端α螺旋的稳定性，导致部分底物结合位点的缺失，最终阻止了酶分子活性状态的形成。这些发现不仅揭示了别构抑制剂在PMT家族中的潜在应用前景，也为开发针对PMT的新型抑制剂提供了重要的理论依据和实践指导。
结束语
蛋白甲基转移酶，特别是组蛋白甲基转移酶，在异染色质的形成、基因的转录调控以及肿瘤发生与发展过程中扮演着至关重要的角色。因此，组蛋白甲基化研究已成为表观遗传学领域的重要研究内容，吸引了分子生物学、肿瘤学等众多学科的广泛关注，并成为抗肿瘤药物研发的关键靶点。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 2 氧甲基转移酶 | abs60166-2500U | 2500U |
| 重组蛋白 Ligase | UA01001C-B-EA-1 | EA-1 |
| DL 2000 DNA Marker | abs60002-100T | 100T |
| 重组酿酒酵母热激蛋白104 | abs44073446-10ug | 10ug |
