BD CBA Flex Set 技术：人可溶性蛋白多重检测的实验流程与应用

BD CBA Flex Set

BD CBA Flex Set（Cytometric Bead Array，CBA）多重液相蛋白定量技术是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。该技术通过使用具有特定荧光强度的微球，结合流式细胞仪的荧光检测能力，实现对多种可溶性蛋白的定性和定量分析。

试剂盒组分

试剂		容量(货号：558264）	容量(货号：558265）
稀释液	Assay Diluent	1瓶，30ml	1瓶，150ml
捕获抗体稀释液	Capture Bead Diluent	1瓶，5ml	1瓶，30ml
检测抗体稀释液	Detection Reagent Diluent	1瓶，5ml	1瓶，30ml
血清/血浆样本捕获抗体稀释液	CaptureBeadDiluentfor Serum/Plasma	1瓶，5ml	1瓶，30ml
洗液	Wash Buffer	1瓶，130ml	1瓶，650ml
仪器调校微球A1	Instrument Setup Bead A1	1管，0.25ml	1管，0.25ml
仪器调校微球A9	Instrument Setup Bead A9	1管，0.25ml	1管，0.25ml
仪器调校微球F1	Instrument Setup Bead F1	1管，1.0ml	1管，1.0ml
仪器调校微球F9	Instrument Setup Bead F9	1管，0.25ml	1管，0.25ml
PE标记仪器调校微球F1	PE Instrument Setup Bead F1	1管，0.25ml	1管，0.25ml
PE阳性对照	PE Positive Control Detector	1管，0.5ml	1管，0.5ml

实验步骤

步骤	描述	所需时间
1	制备标准品溶液：按照试剂盒说明书，将人可溶性蛋白自由组合试剂标准品溶解并稀释至指定浓度，用于后续的标准曲线绘制。	15分钟
2	混合捕获微球：将人可溶性蛋白自由组合试剂的捕获微球充分混合，确保每种微球均匀分布，以保证捕获效率和检测准确性。	15分钟
3	制备PE标记检测抗体：根据试剂盒说明，将人可溶性蛋白自由组合试剂的PE标记检测抗体进行适当稀释，以确保其与捕获微球上的抗原结合的最优条件。	15分钟
4	样本孵育：将混合好的捕获微球与样本（如细胞培养上清或血清）以及PE标记检测抗体混合，进行两次孵育，第一次孵育1小时，第二次孵育2小时，以促进抗原-抗体复合物的形成。	1小时+2小时
5	仪器校准：使用仪器调校微球对流式细胞仪进行条件设置和校准，确保仪器的检测参数准确无误。	15分钟
6	清洗复合物：对孵育后的微球/样本/检测抗体复合物进行清洗，去除未结合的物质，减少背景干扰，提高检测信号的特异性。	15分钟
7	上机检测：将清洗后的复合物上流式细胞仪进行检测，每个样本检测时间约为30秒，通过检测微球的荧光信号来定量分析样本中的可溶性蛋白。	约30秒/样本
8	数据分析：使用FCAP Array v1.0软件对检测数据进行分析，包括标准曲线的绘制、样本中可溶性蛋白浓度的计算以及结果的统计分析等。	15分钟

以上流程为BD CBA Flex Set技术检测人可溶性蛋白的完整试验流程，各步骤紧密衔接，确保了检测的高效性和准确性。

所需试剂

除了人可溶性蛋白自由组合溶液试剂盒中提供的试剂外，还需要以下产品：

流式细胞仪：需配备双激光系统，其中包含488 nm或532 nm激光器以及633 nm或635 nm激光器，以确保能够检测576 nm、660 nm及大于680 nm的发射光。以下是部分适用于CBA Flex Set检测的流式细胞仪型号及其参数设置：

仪器型号	报告参数	分群参数
BD FACSVerse flow cytometer	PE	CBA Red and CBA NIR
BD Accuri C6 flow cytometer	FL2	FL4 and FL3
BD FACSArrayTM bioanalyzer	Yellow	Red and NIR
BD FACSCanto II flow cytometer	PE	APC and APC-Cy7
BD LSRFortessa flow cytometer	-	-
BD FACSAria III cell sorter	-	-
BD FACSCalibur flow cytometer（双激光）	FL2	FL4 and FL3

流式上样管：12×75 mm BD FalconTM流式上样管或同类产品，用于样本的上机检测。
离心管：15 ml聚丙烯圆锥底离心管或同类产品，用于样本和试剂的混合、孵育及离心处理。
分析软件：CBA Flex Set分析软件，FCAP Array软件（PC机版本：641488 / Mac版本：645447），用于检测数据的分析和处理，包括标准曲线的绘制、蛋白浓度的计算以及结果的统计分析等。

实验操作

1. 制备人可溶性蛋白自由组合试剂标准品

最高浓度标准品的制备：

将一瓶冻干的细胞因子标准品小球转移至15 mL锥形离心管中，标记为最高浓度标准品（2500 pg/mL）。

加入4 mL Assay Diluent进行稀释，并在室温下平衡至少15分钟。

使用移液器轻柔混匀标准品溶液，避免采用涡旋或剧烈振荡的方式。

准备9支12×75 mm流式管，分别标记为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256的稀释倍数。

每支流式管中加入500 μL Assay Diluent。

从最高浓度标准品管开始，逐个加入500 μL倍比稀释液，进行梯度稀释。具体操作如下：

从最高浓度标准品管取500 μL溶液至1:2稀释管，吹打混匀。

从1:2稀释管取500 μL溶液至1:4稀释管，吹打混匀。

依此类推，直至完成1:256稀释管的制备。

最后取1支12x75mm流式上样管中加入500μl Assay Diluent作为阴性指控管（0pg/ml）。

2. 混合人可溶性蛋白自由组合试剂捕获微球

1) 样本为上清液时：

a) 确定BD CBA人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）；

b) 确定试验样本数。注：为避免实验操作中多次加样导致的液体丢失，建议多混合2-3个样本的量；

c) 混合前，每种捕获微球需使用涡旋振荡器充分混匀至少15秒；

d) 按照50 μL/样本确定试验中所需稀释的捕获微球总量。例如，样本数为35，则稀释的捕获微球体积为35 × 50 μL = 1,750 μL；

e) 按照1 μL/样本确定每种捕获微球的体积。例如，样本数为35，则捕获微球的体积为35 μL；

f) 确定捕获微球稀释液的体积：捕获微球稀释液的体积 = 稀释的捕获微球总量 - 捕获微球体积。例如，检测1种因子时，捕获微球稀释液体积为1,750 μL - (35 μL × 1) = 1,715 μL；检测5种因子时，捕获微球稀释液体积为1,750 μL - (35 μL × 5) = 1,575 μL；

g) 将捕获微球与捕获微球稀释液混匀于一管中，标记为“混合捕获微球”。

2) 样本为血清或血浆时：

a) 确定BD CBA人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）；

b) 确定试验样本数。注：为避免实验操作中多次加样导致的液体丢失，建议多混合2-3个样本的量；

c) 混合前，每种捕获微球需使用涡旋振荡器充分混匀至少15秒；

d) 按照1 μL/样本确定每种捕获微球的体积，将微球加入试管中，标记为“混合捕获微球”；

e) 在混合微球管中加入0.5 mL洗液，以200g离心5分钟；

f) 小心去除上清液，避免将微球倒出试管；

g) 按照50 μL/样本确定好的体积，用血清/血浆捕获微球稀释液重悬微球。例如，样本数为35，则血清/血浆捕获微球稀释液的量为35 × 50 μL = 1,750 μL；

h) 重悬捕获微球后，使用前室温孵育15分钟。

3. 制备人可溶性蛋白自由组合试剂PE标记的检测抗体

a) 确定BD CBA人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）；

b) 确定试验样本数。注：为避免实验操作中多次加样导致的液体丢失，建议多混合2-3个样本的量；

c) 按照50 μL/样本确定试验中所需稀释的PE标记检测抗体的总量。例如，样本数为35，则检测抗体的体积为35 × 50 μL = 1,750 μL；

d) 按照1 μL/样本确定PE标记检测抗体试剂的量。例如，样本数为35，则PE标记检测抗体试剂的体积为35 μL；

e) 确定PE标记检测抗体稀释液的体积：检测抗体稀释液的体积 = 稀释的检测抗体总量 - 检测抗体试剂体积。例如，检测1种因子时，PE检测抗体稀释液体积为1,750 μL - (35 μL × 1) = 1,715 μL；检测5种因子时，PE检测抗体稀释液体积为1,750 μL - (35 μL × 5) = 1,575 μL；

f) 用检测抗体稀释液稀释PE标记检测抗体试剂，混匀于一管中，标记为“混合PE检测抗体”。使用前4°C避光保存。

4. 人可溶性蛋白自由组合试剂与样本孵育

1) 标准品与待测样本：

a) 在标准品管中，每管精确移取50 μL已经梯度稀释好的标准品，标准品浓度如下表所示：

管号	浓度（pg/ml)	稀释倍数
1	0	未稀释(Assay Diluent)
2	10	1:256
3	20	1:128
4	40	1:64
5	80	1:32
6	156	1:16
7	312	1:08
8	625	1:04
9	1250	1:02
10	2500	最高浓度标准品

b) 在样本管中，每管精确移取50 μL待测样本；

使用涡旋振荡器充分混匀微球至少5秒钟，每管加入50 μL混合微球。轻柔混匀；
在室温条件下孵育1小时；
每管加入50 μL PE标记的检测抗体，轻柔混匀；
在室温条件下孵育2小时；（期间可进行流式细胞仪的仪器调试）。

5. 上机检测

每管加入1 mL洗液清洗样本，以200g离心5分钟；
小心吸去或轻柔倒掉上清液，每管加入300 μL洗液重悬细胞；
仪器调校完毕后尽快上机检测（为避免标准品及待测样本中细胞因子降解，建议尽快上机检测，如有拖延将样本置于冰上，但不可过夜）。

6. 数据分析

样本收集完毕（FCS2.0格式）后，使用CBA专用分析软件FCAP Array v3.0进行标准曲线绘制及数据分析。

名称	货号	规格
Epithelial-Mesenchymal Transition Antibody MiniAb Set	S0M1001-1 Kit	1 Kit
Pancreatic organoids Cytokine Set, Human	UA090026-S	S
Th2 Cytokine Set, Human	UA090018-S	S
Prostate organoids Cytokine Set, Human	UA090027-S	S