MSD分析原理
MSD（Meso Scale Discovery）分析技术基于电化学发光原理，其工作流程与酶联免疫吸附法（ELISA）相似，主要步骤包括在孔板上包被捕获试剂、封闭、添加样品或校准物、加入检测试剂、读板以及数据分析。MSD分析可采用多种方法，如夹心法、直接法和竞争法等。
MSD板的每个孔内含有多个点（Spot），这些点均为工作电极表面，用于吸附捕获试剂。用户可在板上包被多种捕获分子和试剂，如抗体、碳水化合物、病毒样颗粒、细胞、肽和溶解物等。包被完成后，可同时或分步骤加入样品和含有与电化学发光标签（msd-sulfo-tag™）结合的检测抗体，进行一次或多次孵育。样品中的分析物与固定在电极表面的捕获试剂结合，随后与检测抗体结合形成夹心结构。
加入MSD读板液后，为电化学发光提供适宜的化学环境。将板加载到MSD成像仪（超敏多因子电化学发光分析仪）中，成像仪向板电极施加电压，促使靠近板底部的sulfo-tag通过一系列还原和氧化反应发光。MSD成像仪测量发射光的强度，从而实现样品中分析物的定量测量。
MSD（Meso Scale Discovery）检测技术是一种基于电化学发光原理的超敏多因子检测方法。其核心原理是利用特定的标记物与生物分子之间的相互作用，通过电化学发光信号的检测实现对目标分析物的定量分析。具体而言，采用一种钌的衍生物（Sulfo-tag）对抗原进行标记，同时利用生物素标记的抗原。这两种标记抗原能够协同捕获血清中的目标抗体。随后，将含有捕获抗体的混合物与包被有链霉亲和素的MSD平板相结合。由于链霉亲和素与生物素之间具有高度特异性和亲和力，能够形成稳定的链霉亲和素 - 生物素标记抗原 - 抗体 - 钌的衍生物标记抗原的复合体系。
当将构建好的检测体系置于MSD超敏电化学发光仪中时，仪器会对MSD平板底部的电极施加特定的电压。在电化学反应的驱动下，靠近电极表面的Sulfo-tag标记物发生一系列的氧化还原反应，从而产生发光信号。MSD成像仪通过高灵敏度的光电检测装置，精确测量这种发光信号的强度。由于发光信号的强度与样品中目标分析物的浓度呈正相关，因此可以通过对发光信号的定量分析，实现对血清中抗体的精确定量检测。这种检测方法不仅具有高灵敏度和高特异性，还能实现多因子的同时检测，为生物医学研究和临床诊断提供了强大的技术支撑。
生物素标记药物
生物素标记药物的偶联比受药物分子量和赖氨酸残基（活性伯氨基团）的影响，通常起始偶联比为10:或120:1，标记效率受赖氨酸残基数量、药物浓度和反应pH值影响。若标记时出现沉淀，应降低偶联比。本实验采用10:1的偶联比进行标记，每个分子药物标记2-4个生物素为宜。标记前需用过滤柱除去共轭成分，标记后需过滤除去未标记的生物素和药物，标记结束后可用试剂盒测定标记量。
SULFO-TAG NHSster-E标记药物
（1）偶联反应前，使用脱盐柱进行缓冲交换，去除药物中的防腐剂（如叠氮化钠或EDTA）、含伯胺的缓冲成分（如三胺、甘氨酸）和甘。油注意：此阶段不使用共轭存储缓冲区。标记偶联温度控制在23°C（20-25°C），避光操作。抗体药物浓度不低于0.5mg/mL（推荐1-2mg/mL）。
（2）将用于偶联的蛋白在23°C的偶联温度下平衡，可接受的温度范围为20°C至25°C。根据蛋白质的含量，达到平衡需要10-30分钟。
（3）根据公式计算共轭反应所需的SULFO-TAG NHS-Ester储备溶液的量。
（4）标记前准备，将 SULFO-TAG NHS-Ester 置于涡旋振荡器上振荡 1 分钟，或轻拍容器表面，使瓶底部的冻干物质充分收集。精确称取 150 nmol 的 SULFO-TAG NHS-Ester，加入 50 µL 预冷的纯化水，配制成浓度为 3 nmol/µL 的均一溶液。在操作过程中，应轻柔旋转小瓶，确保所有冻干粉末完全溶解，避免产生气泡或泡沫，以保证后续反应的均匀性与稳定性。
（5）标记反应启动，依据预实验计算结果，将溶解后的 SULFO-TAG NHS-Ester 溶液精准加入到待标记的蛋白溶液中。加入后，立即采用涡旋振荡器以适宜速度混匀反应体系，确保 SULFO-TAG NHS-Ester 与蛋白充分接触，从而启动标记反应。混匀过程应控制在数秒内完成，避免过度振荡导致蛋白变性或活性丧失。
（6）标记反应孵育，将混匀后的反应体系置于 23℃的恒温环境中进行孵育，温度控制范围为 20°C 至 25°C 之间，以确保标记反应在适宜的温度条件下进行。整个孵育过程需严格避光操作，防止光线对 SULFO-TAG NHS-Ester 的光敏基团产生影响，进而影响标记效果。孵育时间设定为 2 小时，在此期间，应尽量减少反应体系的扰动，以保证标记反应的充分进行与标记产物的稳定性。为确保实验结果的可重复性与可靠性，当进行多个制备批次的标记时，务必保持一致的结合条件，包括温度、时间、pH 值、反应物浓度等关键参数，以消除批次间差异对实验结果的影响。
（7）标记后纯化，孵育反应结束后，需对标记蛋白后的进行纯化处理，以去除未反应的 SULFO-TAG NHS-Ester 及其他小分子杂质。将反应体系过纯化柱，在 2-8°C 的离心机中进行心离操作，通过适当的选择和优化离心速度与时间，使杂质与标记蛋白得以有效分离，从而获得高纯度的标记蛋白产物。离心过程中，应确保温度的稳定性，防止温度变化对蛋白的活性和稳定性产生不利影响。
（8）过滤处理，为了进一步去除标记蛋白溶液中可能存在的微小颗粒杂质或聚集体，建议使用 0.2µm 孔径的过滤器对纯化后的结合蛋白溶液进行过滤处理。在过滤过程中，应采用温和的操作方式，避免过度压力或剧烈搅拌对蛋白结构造成破坏，确保蛋白的生物活性得以保留，同时提高溶液的澄清度与均一性，为后续的实验应用提供高质量的标记蛋白。
（9）蛋白浓度测定，采用标准比色蛋白测定法，如 BCA（Bicinchoninic Acid Assay）、Bradford 或 Lowry 法等，对标记后的蛋白进行浓度测定。通过这些比色法可以准确地确定共轭蛋白的摩尔浓度，为后续实验的定量分析提供可靠依据。在测定过程中，应严格按照所选方法的操作步骤进行，包括标准曲线的绘制、试剂的准确配制与添加、以及比色反应的条件控制等。需特别注意的是，避免使用 OD280 吸光度读数来测定蛋白浓度，因为 SULFO-TAG NHS-Ester 本身也会吸收该波长的光，从而导致测定结果的偏差与不准确。
（10）标记物浓度测定，利用分光光度计在 455nm 波长处，对 SULFO-TAG NHS-Ester 标记蛋白中的 SULFO-TAG NHS-Ester 含量进行吸光度测定。将测得的吸光度值除以光程长度（单位为厘米），再除以 SULFO-TAG NHS-Ester 的消光系数（15，400 M⁻¹cm⁻¹），即可计算得到 SULFO-TAG NHS-Ester 的标记浓度（单位为 mol/L）。具体的计算公式如下：
SULFO-TAG NHS-Ester 标记浓度 (mol/L)=光程长度 (cm)×消光系数 (15,400 M⁻¹cm⁻¹)吸光度值
（11）标记蛋白的偶联率计算，将步骤 10 测得的 SULFO-TAG NHS-Ester 标记浓度值除以步骤 9 测得的摩尔蛋白浓度值，通过以下公式计算 SULFO-TAG NHS-Ester 标记蛋白的偶联率：
（12）标记蛋白的稳定性与储存条件，SULFO-TAG NHS-Ester 标记的抗体在 2-8°C 条件下，浓度维持在 1-2 mg/mL 时，至少可稳定保存 2 年。对于其他类型的标记蛋白，其稳定性需通过实验进行验证。为确保标记蛋白的长期稳定性，可选择在 ≤-20°C 或 ≤-70°C 的条件下进行冷冻保存。需注意，SULFO-TAG NHS-Ester 标记蛋白对长时间光照敏感，应储存在黑暗、琥珀色或不透明的小瓶中，以防止光致降解。在进行分析时，偶联物短时间暴露在光线下对实验结果的影响可忽略不计。若蛋白浓度较低（<0.1 mg/mL），为增强蛋白的稳定性，可考虑添加载体蛋白，如添加 0.1% 的 MSD 封闭液 A。
