蛋白磷酸化检测方法综述

蛋白磷酸化检测

蛋白质翻译后修饰（PTMs）在生命活动中具有至关重要的作用。它能够显著增加蛋白质结构的复杂性，完善蛋白质的功能，使生物调节过程更为精细和专一。PTMs涵盖多种共价修饰，包括磷酸化、糖基化、甲基化、羟基化、脂酰化、羧基化等。其中，磷酸化修饰因在生物过程中扮演的关键角色而成为研究热点。它广泛参与基因转录与表达调控、细胞增殖与分化、细胞凋亡、信号转导、免疫调控以及肿瘤发生等多种生物学事件，对生命活动的精确调控和疾病发生发展具有深远影响。

一、蛋白磷酸化简介

二、蛋白磷酸化的检测方法

1. Western Blot（WB）

WB 是定性检测蛋白磷酸化水平的金标准，广泛用于评估蛋白磷酸化状态。其基本流程包括：首先通过 SDS-PAGE 分离蛋白样本，然后将蛋白转膜至 PVDF 或尼龙膜上，随后孵育磷酸化位点特异性抗体及辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，最后添加 HRP 底物以检测抗体结合的磷酸化蛋白质。只有被磷酸化修饰的蛋白才会在相应分子质量处显现特异性条带。

WB 的灵敏度和特异性高度依赖于所使用的抗体。许多磷酸化特异性抗体具有高灵敏度，能够轻松检测常规样品（如 10~30 μg 细胞提取物）中的磷酸化蛋白。然而，若抗体与样品中的其他蛋白质发生非特异性结合，将会影响结果的判读。此外，由于磷酸化蛋白水平可能随时间处理或凝胶上样误差而出现偏差，研究人员通常会利用针对目的蛋白总水平的抗体进行平行检测，以确定磷酸化组分的相对比例变化，并作为上样内对照。

WB 检测方法的特点包括：操作简便，只需化学发光成像仪即可，一般实验室都具备这个条件；特异性好，分辨率高，可以识别特定的磷酸化位点。然而，特异性磷酸化抗体的制备较为困难，导致许多特异性位点的磷酸化检测受限；操作较为复杂，通常需要 1~2 天，不适合大量样本，但适用于单个蛋白磷酸化检测；测定的磷酸化水平受样品处理和凝胶上样误差的影响。对于低丰度蛋白，可以通过免疫沉淀（IP）使用目标蛋白的抗体进行富集，再进行 WB 检测，从而显著提高检测效率。

2. 32P 同位素放射性标记法

32P 同位素放射性标记法是一种直接测定蛋白磷酸化的经典方法。其基本流程是将整个细胞与放射性标记的 32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物后，通过 SDS-PAGE 分离，并识别电泳凝胶上的同位素蛋白点以检测磷酸化蛋白质。该方法通过体内代谢培养，利用 32P 同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸化酶促反应，带有 32P 标记的磷酸基团转移到相应蛋白上，再通过凝胶电泳分离和放射自显影检测磷酸化蛋白质。

32P 同位素放射性标记法操作简单，适用于蛋白磷酸化位点检测以及单个蛋白磷酸化检测，能够提供具有生物学意义的确切磷酸化位点。然而，该方法仅限于细胞内应用，且存在放射性危险。

3. 质谱（MS）

质谱（MS）是评估复杂生物样品中蛋白质磷酸化的强大工具，尤其适用于磷酸化蛋白质组学分析和药物靶点鉴定。目前，高精准度质谱仪能够快速、准确地分析细胞中高丰度蛋白的磷酸化修饰。其主要流程包括：通过 SDS-PAGE 或 2D-PAGE 分离目标蛋白，切下含目标蛋白的条带，使用胰酶消化，根据 MS“自下而上”的方法，将蛋白质消化成肽段，最后通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）检测分析蛋白序列和磷酸化修饰位点。对于磷酸化丰度较低的目标蛋白，可以通过固定化金属亲和层析（IMAC）、TiO2 亲和层析或泛磷酸化抗体富集等方法提高磷酸化肽段的比率，再进行质谱分析。

MS 的特点包括：设备要求高，精准度高，能够同时检测多个蛋白的多个磷酸化位点；不依赖于磷酸化抗体，可以识别新的磷酸化事件；动态范围高达 5 个数量级，能够在较低浓度下检测磷酸化蛋白；适用于大规模分析蛋白磷酸化水平。然而，测序结果分析相对复杂，需要依赖专业分析软件和生物信息技术平台。

 

4. ELISA

ELISA 是测定蛋白磷酸化的有力方法，尤其适用于信号通路中涉及的细胞内蛋白的研究。一般采用传统的夹心法 ELISA 或基于 ELISA 抗体对的类似分析平台进行分析。其基本流程是将目的蛋白的特异性捕获抗体包被在分析板中，加入样品孵育，洗涤去除未结合物质，然后加入磷酸化位点特异性抗体和酶标二抗，最后加入底物和终止液，通过酶标仪读取吸光度。样品中磷酸化蛋白的含量不同，溶液会呈现出不同程度的颜色，吸光度水平与检测到的目的蛋白量成正比。

此外，基于细胞的 ELISA 也被开发出来，能够在完整细胞的背景下测定蛋白磷酸化。细胞在同一个孔中被刺激、固定和阻断，也可在同一个孔中同时检测磷酸化蛋白和总蛋白。因此，来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估。

ELISA 的特点包括：操作简单，分析快速，只需使用酶标仪读取数据，一天内就能完成；使用两个抗体特异性更高，灵敏度也高，允许使用更少量的样品，检测低丰度蛋白；通过校准的标准品可以轻松对定量；可以做到高通量，也可以进行多重分析（即多个位点磷酸化的同时分析）。

5. 流式细胞术

流式细胞术主要用于检测细胞表面蛋白，但也可以分析细胞内蛋白，如磷酸化蛋白。只要目的蛋白磷酸化抗体、总蛋白抗体或细胞表面标志物蛋白分别带有不同的荧光标记，流式细胞仪就可以利用激光激发用于抗体检测的荧光染料，并在不同通道捕获磷酸化相关信号和其他信号，如总蛋白信号或细胞表面标志物信号，从而在同一个细胞中同时评估多个指标（包括磷酸化水平、总蛋白水平等）。流式细胞术采用荧光标记的单细胞悬液为检测样品，通过检测标记荧光的荧光强度来确定蛋白磷酸化的水平，因为偶联荧光素的磷酸化抗体只与蛋白质的磷酸化形式结合，荧光强度与磷酸化水平呈正比。如果要评估同一个细胞中的多个蛋白，必须精心选择滤光片组合和荧光染料，确保其光谱不重叠。因此，流式细胞术也可以同时在不同的细胞亚群中分析几种信号通路组成元件，大大提高工作效率。

此外，培养的细胞或组织切片原位也可以利用免疫荧光的方法进行磷酸化分析，进而评估蛋白磷酸化对蛋白定位、活性等方面的影响。例如，免疫细胞化学（ICC）通常指利用显微镜对培养细胞中的蛋白进行检测，而免疫组化（IHC）是对完整组织切片中的蛋白进行检测。采用流式细胞术和 ICC/IHC 的方法检测蛋白磷酸化需要高亲和力、高特异性的抗体、阻断步骤、对照和抗体滴定，以及要求蛋白必须是稳定的，且抗体能够接近。因此，一般都需要新鲜取材并尽量减少处理过程对细胞或组织中蛋白磷酸化的损害，并通过甲醛或多聚甲醛固定，以交联磷酸化蛋白，使其稳定，便于分析。固定后的细胞必须经过透化处理，使磷酸化特异性抗体能够进入细胞。

流式细胞术的特点包括：可以实现快速、定量的单细胞分析；对于异质群体，通过细胞表面标志物表型分析可以检测特定细胞类型中的目的蛋白，而无需预先分离细胞；适合分析小的、稀少的细胞群，且不必担心在细胞分选过程中发生细胞损失或蛋白表达改变。然而，该方法需要特异性荧光染料，耗费较高，且仪器昂贵。