Complete biosynthesis of QS-21 in engineered yeast
2024年5月8日，美国加州大学伯克利分校的Jay D. Keasling研究团队在国际顶级学术期刊《自然》（Nature）上发表了一项突破性研究成果，题为“Complete biosynthesis of QS-21 in engineered yeast”。该研究成功地在工程酵母中实现了疫苗佐剂QS-21的全生物合成。QS-21作为一种重要的疫苗佐剂，能够显著增强疫苗的免疫原性，但其复杂的化学结构使得传统的提取和化学合成方法面临产量低、成本高的挑战。Keasling团队通过在工程酵母中构建和优化QS-21的生物合成途径，解决了这一关键问题，为疫苗佐剂的大规模生产提供了新的途径。
研究背景
佐剂（Adjuvants）通过刺激或增强机体对病原体或疾病特异性抗原的免疫反应来提高疫苗的效力。自上世纪20年代发现以来，明矾（氢氧化铝）一直是临床应用最广泛的疫苗佐剂（铝佐剂）。近年来，QS-21已显现出强大的免疫活性，是唯一用于人类临床的皂苷佐剂，并成为佐剂系统AS01和Matrix M中的活性成分。这些制剂已被用于葛兰素史克的疟疾疫苗（Mosquirix）和带状疱疹疫苗（Shingrix），以及Novavax新冠疫苗。由于QS-21强大的免疫反应和良好的安全性，研究人员已经在120多项临床试验中测试了QS-21。
尽管具有巨大的商业价值，但QS-21的可获得性仍然受限，主要由于其复杂的结构。QS-21由四个不同的结构模块组成：（i）亲脂性三萜母核皂皮酸（quillaic acid，QA）；（ii）连接在QA C3上的侧链三糖部分；（iii）连接在QA C28上的线性四糖链；（iv）由阿拉伯呋喃糖封端的独特假二聚酰基链。由于两种异构体的结构相似（唯一的区别是C28位末端糖），QS-21以QS-21-Api（呋喃糖型）和QS-21-Xyl（吡喃糖型）（65:35）的非均相混合物形式存在。QS-21主要从智利皂皮树（Chilean soapbark tree，Quillaja saponaria）树皮中提取获得。这种方法费力且产量低。现已实现以中间体皂苷为起始原料，对QS-21的Xyl和Api形式的化学全合成。然而，化学合成路线长达76步且产率极低。因此，开发更可持续和可工业化的替代生产工艺，将有助于满足对强效疫苗佐剂日益增长的需求和应对现有或新出现的医疗需求。近期，Anne Osbourn 团队已经完全解析了皂皮树中QS-21的完整生物合成途径，这为利用合成生物学技术生产QS-21提供了可能。
研究内容
本研究中，基于前期解析的皂皮树中QS-21的完整生物合成途径，作者在酿酒酵母中仅以单糖（葡萄糖和半乳糖）为原料，实现了QS-21-Api和QS-21-Xyl及其衍生物的全生物合成。为了实现这一点，作者首先上调了酵母中的甲羟戊酸（MVA）途径，以提高前体2, 3-氧化鲨烯的供应，然后通过利用多种植物源 β-香树脂醇（β-Amyrin）合酶使其发生环化合成QS-21的三萜母核，优化实现了β-Amyrin的高产（899.0 mg/L），并通过导入植物源CYP450进行位点选择性氧化，成功合成了QS-21的三萜苷元QA，通过多种优化策略实现了QA的高产（摇瓶65.2 mg/L）（Fig. 3）。
QS-21的生物合成涉及8个糖基化步骤，需要7种不同的UDP-糖：UDP-D-葡糖醛酸（UDP-GlcA）、UDP-D-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-木糖（UDP-Xyl）、UDP-D-岩藻糖（UDP-Fuc）、UDP-L-鼠李糖（UDP-Rha）、UDP-D-芹菜糖（UDP-Api）和UDP-L-阿拉伯呋喃糖（UDP-Araf）。其中，UDP-Gal是酵母天然生产的唯一UDP-糖，可通过半乳糖代谢或UDP-葡萄糖异构化获得。为了在酵母中实现QS-21的生物合成，研究团队引入了植物源核苷酸糖合成途径及相应的糖基转移酶（GTs），通过共表达QS-21途径的GTs，将多种糖添加到皂皮酸（QA）的C3羟基和C28羧基上。
此外，作者在酵母中引入并表达了一种工程化的I型聚酮合酶（PKS）、两种III型PKS和两种独立的酮还原酶（KR），以实现QS-21生物合成途径中最后一步的酰基二聚体的形成（Fig. 5）。
总结与展望
综上所述，本研究成功地在酿酒酵母中实现了QS-21及其衍生物的全生物合成。除了对酵母的天然甲羟戊酸（MVA）途径进行精细调控外，研究团队还构建了最终菌株，以实现38种异源酶的功能性平衡表达。这些酶来源于6种生物的7个酶家族，包括萜烯合酶、CYP450、核苷酸糖合酶、糖基转移酶、辅酶A连接酶、酰基转移酶和聚酮合酶。此外，研究团队还在酵母中模拟了植物从内质网膜到胞质的亚细胞区室化环境，以优化QS-21的生物合成。这一系列复杂的遗传和代谢工程改造，使得QS-21的两种主要异构体——QS-21-Xyl和QS-21-Api——能够在不同的酵母菌株中分别生产，从而实现它们的独立纯化和免疫活性评估。
酵母生物合成平台的建立，为生产QS-21结构类似物提供了前所未有的机遇。通过表达替代途径的酶、制造QS-21的片段，或利用酶的杂泛性，可以开发新型疫苗佐剂的先导化合物。例如，通过表达鼠李糖转移酶（UGT73CX2，C3RhaT）替代木糖转移酶，可以使C3位三糖链中的木糖被鼠李糖（多一个甲基）取代。这种含有鼠李糖的三糖底物，不仅能够被下游途径的酶利用，还可以方便地生成QS-21的甲基化衍生物。在研究QS-21聚糖功能时，通过有目的地忽略某些糖基转移酶（GTs），可以产生截短的低聚糖，这一策略在21的成功生物合成中得到了充分验证。这种微生物生产方案，将有助于深入解析QS-21的结构与功能关系，从而推动强效疫苗佐剂的理性设计和创制。
传统上，从智利皂皮树中提取和纯化QS-21的方法，不仅破坏了树皮，还促使政府部门加强了对其森林砍伐的监管。本研究在工程酵母中实现了QS-21的全生物合成，这一突破性进展突显了用大规模工业发酵替代基于植物的皂苷供应的可能性。这不仅可以显著增加QS-21的供应量，以满足对强效疫苗佐剂日益增长的需求，还可以减少对自然资源的依赖和破坏。
目前，本研究中构建的菌株YL-46能够产生约0.0012%（w/w，细胞干重）的QS-21，虽然低于皂皮树的产量（0.0032%），但酵母的生产周期短，生产速度比皂皮树快约1000倍。皂皮树需要在树龄达到30至50岁时才能产生QS-21。尽管菌株工程、生产与发酵方案以及下游提取和纯化工艺的进一步优化，对于大规模生产酵母衍生的QS-21仍然是必要的，但该领域以抗疟疾药物青蒿素前体青蒿酸的工业化生产为代表的里程碑式成功，为微生物生物制造的新机遇铺平了道路。本研究再次彰显了合成生物学在解决主要环境和人类健康挑战方面的巨大潜力。研究人员构建的酿酒酵母平台生产QS-21的产率虽然还很低，这为合成生物学家提出了一个有趣的挑战。
