APOE4/4 is linked to damaging lipid droplets in Alzheimer's disease microglia
2024年3月，斯坦福大学医学院相关研究人员在《Nature》（IF: 64.8）上发表了题为“APOE4/4 is linked to damaging lipid droplets in Alzheimer’s disease microglia”的研究论文，该研究揭示了阿尔茨海默病的遗传风险因素与小胶质细胞脂滴积累和神经毒性小胶质细胞衍生因子之间的联系，为阿尔茨海默病的治疗提供了潜在策略。
亮点概述
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在具有APOE4/4基因型的阿尔茨海默病患者中，表达ACSL1的小胶质细胞最为丰富。
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纤维状Aβ在人诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞中以APOE依赖性方式诱导ACSL1表达、甘油三酯合成和脂滴积累。
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含有脂滴的小胶质细胞的条件培养基会以APOE依赖性方式导致Tau磷酸化和神经毒性。
研究背景
阿尔茨海默病（AD）最初被描述为在痴呆患者大脑中存在“许多显示脂肪囊状物的神经胶质细胞”。与AD相关的斑块和缠结病理相比，胶质 - 脂质特征在AD研究中受到的关注较少。APOE是一种与脂质相关的AD风险基因，在AD患者的人类小胶质细胞中高度上调，而具有APOE风险变体的人类诱导多能干细胞（iPS）衍生的小胶质细胞（iMG）含有更多的脂滴（LDs）。研究发现，老年小鼠小胶质细胞会积累LDs，并表现出一种称为LD积累小胶质细胞（LDAM）的功能失调状态。
LDs在髓细胞中通过上调脂质合成酶形成，这种合成酶是由先天免疫触发因素（如细菌）与toll受体结合触发的。LDs本身具有抗菌特性，是巨噬细胞中先天免疫防御的一种进化保守形式。在脱髓鞘小鼠模型和人类iPS细胞模型中，也观察到功能失调的小胶质细胞中存在富含胆固醇的溶酶体和LDs。目前尚不清楚人类AD脑组织中脂质积累的神经胶质状态是否受脂质AD风险变异（如APOE）影响，以及AD中报道的脂质积累神经胶质细胞是否与最近发现的LDAM相似，其在AD发病过程中是发挥良性、保护还是破坏性作用，仍有待进一步探索。
为了探究死后人类AD脑组织的转录状态与APOE基因型的关系，研究人员对诊断为具有APOE4/4基因型的AD患者、具有APOE3/3基因型的AD患者以及具有APOE3/3基因型的年龄和性别匹配的对照者的新鲜冷冻额叶皮层组织进行了单核RNA测序（snRNA-seq）。分析显示，与对照组相比，ACSL1在AD脑组织的小胶质细胞中特异性上调，且在APOE4/4小胶质细胞中的上调程度更高。所有小胶质细胞亚群中，ACSL1+小胶质细胞构成了一种不同于内环境平衡和疾病相关小胶质细胞（DAM）的状态，其含有更多代谢状态调节因子（如NAMPT和DPYD）的共同表达。由于在ACSL1+小胶质细胞簇中存在一组LD相关基因，研究人员将这些ACSL1+细胞称为LDAM。研究发现，AD-APOE4/4脑组织中LDAM的比例最高，其次是AD-APOE3/3，而年龄匹配的对照脑组织中LDAM的比例最低。
随后，研究人员采用油红O（一种中性脂质染料）对AD和对照脑切片进行染色，以测量细胞内脂质积聚情况。结果显示，AD-APOE4/4患者的大脑呈现出丰富的核周油红O阳性脂质体，类似于脂滴（LD）。这些脂质体在AD脑组织中广泛存在，与AD-APOE3/3患者相比，AD-APOE4/4患者的脂质体虽有增加趋势，但差异并不显著。值得注意的是，油红O阳性细胞常出现在淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块的核心附近或核心处。类似地，在Aβ斑块附近也经常观察到ACSL1阳性小胶质细胞，这提示在斑块附近含有脂质体的细胞可能是ACSL1阳性小胶质细胞。通过精神状态检查测量发现，脂质体的数量与认知能力呈负相关，而与Aβ斑块数量和Tau病理水平呈正相关。此外，小胶质细胞中ACSL1的表达与脂质体的相对数量呈正相关。在小鼠相关模型中也观察到了与人类样本类似的现象。
为了直接测试 APOE 基因型是否促进小胶质细胞中脂滴（LD）的积累，研究人员将APOE4/4和同基因的APOE3/3 iPS细胞分化为小胶质细胞。使用中性脂质荧光染料（LipidSpot）对诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞（iMG）进行活细胞显微镜检查，发现与同基因APOE3/3 iMG相比，APOE4/4 iMG中的LD积累更多。用纤维状Aβ（fAβ）处理iMG会导致LD积累显著增加，而APOE4 AD风险等位基因的存在则进一步加剧了这种情况。在APOE敲除（APOE -KO）背景下，fAβ对LD积累的影响消失。类似地，LD相关基因PLIN2和ACSL1的表达在iMGs中经fAβ刺激时上调，且在APOE4/4背景下上调幅度更大。
为了确保fAβ对小胶质细胞中LDs的诱导不是这些iPS细胞系或分化方案所独有的，研究人员用fAβ处理原代大鼠小胶质细胞、原代人类巨噬细胞和小鼠BV2小胶质细胞，同样观察到LDs的积累。进一步在iMG上进行相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）成像，以确认fAβ刺激后APOE基因型之间的不同脂质积聚。CARS成像分析显示，fAβ处理的iMGs中LD光谱与不饱和（甘油三酯）光谱重叠。
为了研究这些脂质是否是响应fAβ从头合成的，研究人员使用氘代葡萄糖处理BV2小胶质细胞。脂质组学分析显示，fAβ刺激后氘代葡萄糖的甘油三酯掺入呈时间依赖性增加。此外，通过全基因组CRISPR-KO筛选评估人类基因组中哪些特异性脂质合成基因在LD积累中起作用。结果表明，甘油三酯代谢调节因子是LD积累所需的最重要的基因类别，而ACSL1是LD形成所需的最重要的基因之一。ACSL1抑制剂可逆转APOE4/4 iMG中LD在fAβ刺激下的积累。
接着，为了评估LD积累的小胶质细胞的转录组学和表观遗传学状态，研究人员对LD-高和LD-低iMG进行了流式细胞荧光分选（FACS），然后进行ATAC-seq和RNA-seq。LD-高小胶质细胞特异性的ATAC-seq峰显示与转录因子NF-κB家族相关的基序富集。与LD-低小胶质细胞相比，LD-高小胶质细胞具有更高的NF-κB相关促炎细胞因子（如TNFA和IL1B）表达和更低的小胶质稳态标记物表达。含有LD的APOE4/4 iMGs在吞噬作用、积累溶酶体和分泌炎症相关趋化因子方面表现出功能失调。
最后，为了探究LDAM对神经元的影响，研究人员利用流式细胞荧光分选（FACS）将APOE4/4 iMG分为LD-高（顶部10% BODIPY信号）和LD-低部分（底部10% BODIPY信号），并在神经基底培养基中培养12小时，以制备条件培养基。随后，将APOE4/4 iPS细胞衍生的人神经元在含有10% LD-高或LD-低的APOE4/4 iMG条件培养基以及未处理的对照条件的完全培养基中培养。使用单克隆抗体AT8对人iPS细胞衍生的神经元进行染色，以检测磷酸化Tau（pTau）。结果显示，仅有LD-高iMG条件培养基能够诱导iPS细胞衍生的神经元产生高水平的pTau。
当采用来自APOE3/3和APOE4/4 iPS细胞衍生的iMG的条件培养基处理人神经元时，观察到了类似的效果；然而，当使用来自APOE-KO iMG的条件培养基时，这种作用则消失了。同样地，含有较高浓度LDs的APOE3/3和APOE4/4 iMG的条件培养基诱导了人类神经元中半胱氨酸蛋白酶（caspase）的激活，而APOE-KO iMG的条件培养基则未产生影响。
总之，本研究揭示了APOE4基因型促使小胶质细胞在面对Aβ等先天免疫触发因素时，转变为进化保守的、具有适应不良和破坏性的LDAM状态。这一发现为LDAM介导的AD发病机制的新假说提供了可能性，开辟了新的研究方向。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| beta-Amyloid (D3D2N) Mouse mAb | 15126T | 20ul |
| beta-Amyloid (D3D2N) Mouse mAb | 15126S | 100ul |
| RNeasy Plus Micro Kit (50) | 74034 | 50Test |
| STEMFLEX(TM) MEDIUM | A3349401 | COMBOKIT |
