Cytometric Bead Array（CBA）
一、检测原理
Cytometric Bead Array（CBA），即微量样本多指标流式蛋白定量技术，是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。在日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，例如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析。由于这些因子的含量通常较低，低于一般常规方法的检测下限，使用常用的蛋白检测方法（如 Western Blot）很难检测到。CBA 系统通过利用一系列带有荧光标记的微小、分散的微球连结特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物，通过对应各种不同检测物的特异微球上所带有荧光强度的不同，从而同时测定分析样本中多种可溶性成分的数量。
CBA 系统的工作原理较为简单。对应受检系统中的每一个检测指标都设有不同的捕获微球，不同的捕获微球上包被有特异的捕获抗体，并具有不同的荧光强度。通过将捕获微球与待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或细胞培养液）中的相应抗原或蛋白结合。最后，加入荧光的检测抗体以形成“三明治”夹心复合物，通过流式细胞仪进行荧光检测，便可对样品中的各检测因子的含量进行分析。由于 CBA 系统中每一个微球都能够提供一个和特定蛋白结合的表面，因此，每个微球就相当于一个单独的、包被好的 ELISA 板。相对于传统的 ELISA 技术，荧光信号显色的灵敏度比一般化学发光的灵敏度高，加上利用流式细胞仪对于荧光信号的高敏感性及放大作用，使用这种技术检测未知样品中的指标所需要的样品浓度更低，实验时间更短。另外，常规的 ELISA 操作，每次只能对一个样本中的一个指标进行检测，各检测指标间的操作需分开进行，往往造成珍贵样本的耗费。例如病患者血液中的免疫调节细胞因子（包括 IFN-γ、TNF-α、IL-2 等），通过 CBA 系统，可同时对一个样品中的多个指标进行检测，这为一些 ELISA 技术无法满足的实验提供了新的检测手段。
二、技术特点（与 ELISA 比）
CBA 是集 ELISA 和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术。CBA 的每一种微球提供一种蛋白的捕获表面，捕获微球与待测样品混合后，呈悬浮态，与 ELISA 相比，能更有效地捕获被分析物；CBA 具有 FCM 的宽范围荧光检测特点，对样本需求量更少，检测更快速、更准确。
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轻松实现多重检测：最多可同时对一个样本中的 75 个目的蛋白进行精确定量。
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样本需要量小：仅需要 50μL 溶液就可进行一次检测。
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更高的灵敏度：分析灵敏度高达 2.8pg/mL。
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更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性：CBA 技术使蛋白定量的分析灵敏度高达 pg/ml 级别，检测范围达 0-5000pg/ml，所有分析只需一组标准曲线。根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量，排除了 ELISA 反应中酶联放大产生的假阳性。
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检测对象的灵活组合——CBA Flex Set：可以根据需要组合不同的捕获微球来检测多个指标，最多能同时检测 75 个指标。除了拥有 CBA kit 的优势外，Flex Set 还配有独立的软件分析系统（CBA Flex Set Analysis Software），并且可以在 FACSArray Bioanalyzer 上，直接用 96 孔和 384 孔板进行操作。CBA Flex Set 赋予研究者更灵活、更自由，更大的选择空间。种类涉及免疫、细胞信号传导、细胞凋亡等许多领域的蛋白定量分析。
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操作简单，省时省力：CBA 技术采用芯片式集成测定，所有检测只需一组标准曲线，就可计算出每种待测蛋白浓度；操作简单，整个流程只需要 3.5 小时，对待测样本可做实时分析，缩短了检测时间，提高了检测效率。
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强大的软件分析系统：BD CBA 软件具有强大的数据处理能力，直接将目标蛋白的检测结果换算成标准浓度；除了为用户提供待测物的计数结果外，还能提供可视轮廓或信号图形以帮助用户获得更多的信息。有用于 Macintosh 和 Microsoft 系统两种版本供您选择。和传统的液相蛋白定量技术相比，CBA 技术是一种“多元”和“同步”的检测技术。
三、CBA常见问题分析
包括样本准备、上机检测、结果分析三部分内容
Q：我能不能使用 Coulter XL 去分析我的 CBA 数据？
A：虽然 CBA 试剂盒是为 BD FACScan® 和 FACSCalibur® 流式细胞仪设计的，但 CBA 试剂盒也可以通过 Coulter XL 细胞仪检测。CBA 版本 1.3 以上的软件具有参数兼容性的特征，可以使用非 BD 公司的仪器分析实验数据。请参阅软件的用户使用指南或者联系技术支持得到进一步的信息。
Q：实验过程中，除了 CBA 的分析试剂盒，我们还需要准备什么？
A：除了试剂盒中所包含的成份外，若要进行 CBA 分析实验，还需要购买 BD 的微量样本多指标流式蛋白定量技术分析软件。此软件主要用于分析您的实验数据。虽然实验数据的分析可以不使用 CBA 的特定软件，但由于 CBA 实验中所采集的数据较为繁杂，若不通过专用的 CBA 软件进行分析，则进行数据分析的时间将显著增加。CBA 的专用软件是建立在 Microsoft Excel 的基础上的，用户只需要完全安装 MS Excel 98 或者 Version 5.0 即可安装 CBA 的专用软件。此外，用户还需要一个 488 纳米激光器及 3 个荧光参数的接收的流式细胞仪。
Q：CBA 中使用的微珠是由什么做的？所使用到的微珠的平均半径是多少？
A：CBA 中使用的微珠的原料是聚苯乙烯，平均半径约为 7.5μm。
Q：在 CBA 分析中我应该使用何种型号的试验管？
A：除了 FACSArray 外，建议使用 12×75 mm，5 ml 的聚苯乙烯管。
Q：CBA 分析中在进行标准曲线的配制时，有什么需要特别注意的地方？
A：CBA 试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉。由于大部分的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋白，在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时，不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品。在重悬标准样品成溶液时，在加入溶液后，只需放于室温下平衡 15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时，只需轻轻吹打样品数次即可。否则，由于制成溶液后的标准样品不稳定，经剧烈混匀后易降解失活，影响实验中标准曲线的拟制。
Q：是不是每次实验都要使用一瓶新的标准品？
A：标准品在配成溶液后不稳定，无论是标准品储备液（x10）还是实验中的稀释液，配制成储备液（x10）的 12 小时后将不能再使用。因此，在每次实验前都要重新配置新的标准品溶液。
Q：为什么振动混合微珠这个实验步骤如此关键？
A：在使用之前，微球必须充分振动混合。从在微球混合液试管中加入另外一种微球之前，至微珠添加完毕后，直至在送到仪器进行上样检测之前，反应管都必须充分振动混合。这是因为充分的振动能够防止微珠聚集成团。若混合不足会导致在进行样品分析时出现检测到很少或者没有检测到微珠的情况。因此，在使用流式细胞仪分析标准品或者样品之前，必须充分振荡混合微珠。试验管在放置到流式细胞仪上检测前需要振荡混合 3-5 秒钟，这样在 FL3 通道里面能够更好地分辨出带有不同标志的微珠。
Q：CBA 操作实验中，哪些步骤需要避光进行？为什么？
A：凡涉及含捕获微球及检测抗体的相关步骤都需避光操作。这是因为 CBA 技术是使用 R-藻红蛋白检测样品的荧光信号。由于使用 R-藻红蛋白报告系统，可使 CBA 达到最佳敏感度的分析效果，因此每步添加了检测试剂后都要避光反应。此外，在加入检测试剂时，除了需避光操作外，还需严格遵守试剂盒的要求规范操作（比如：精确的加液），因为添加的微珠数量不准确会改变有效捕获面积从而影响检测的敏感性。
Q：我看不到 FL2 荧光信号或者看到的 FL2 荧光信号很弱，怎样解决这个问题？
A：请检查样品的稀释度，不要随意更改要求的孵育时间，并在孵育过程中保护样品试剂管不受到光照。
Q：实验中，在检测的时候我发现微珠聚集在一起，这是什么原因？
A：这可能是因为样品中的细胞因子的浓度太高。此外，在实验前，请按试剂盒上的操作说明对流式细胞仪上各荧光补偿进行仔细调节，以确保所使用流式细胞仪参数是对应于 CBA 操作的最优化设定。
Q：为什么在实验中我的实验结果背景很强/或者全部样品都显示高度的阳性？
A：实验结果背景很强可能是因为样品的浓度太高。请对您的样品，尤其是首次进行检测的体系，进行不同稀释度的检测。如果所有样品都显示阳性或者高于标准品的最高浓度读数，这时候请对您的样品进行进一步的稀释，因为您的样品的浓度已高于本系统的正常检测范围。
Q：为什么在实验中会出现看到微珠碎片和没有看到微珠的情况？
A：如果在样品分析时在 FSC/SSC 的检测图中出现碎片，可上调 SSC 的阈值 C 或者同时上调 FSC 和 SSC 的双阈值。如果在调整 SSC 的阈值以后问题依然存在，请重复样品的洗涤步骤或者再次稀释样品。
Q：CBA 的检测结果是否可直接与 ELISA 的分析结果进行对比？
A：不可。因为 CBA 是基于荧光的报告系统实现的。虽然 CBA 系统相对于 ELISA 分析具有良好的优势，能够提供更高的敏感性和更大的浓度检测范围，但两者得出的实验数据不能直接比较，需对 CBA 的数据通过和已有的 ELISA 数据进行校正，得到两者的相关性结果。
Q：在血清和血浆中，CBA 试剂盒所能够检测到的最低浓度是多少？
A：不建议研究者根据标准曲线外推低于标准曲线最低值的实验报告数值。这样的外推操作会增加结果的数学统计学上的变化程度和导致标准差值的增大。最理想的情况是在做标准曲线时增加额外的稀释浓度点（如 10、5、2.5、1.25 pg/ml）。当一些蛋白相对于背景（0 pg/ml）没有信号的情况下，可在最后的样品分析中将这种蛋白排除掉。在常规的免疫分析中，血清和血浆中的一些细胞因子的含量低于检测的最低值以至于不能被检测到。这是因为绝大部分的细胞因子在具有特殊的免疫活性的位点附近起作用，它们的作用效率很高，在许多情况下它们的半衰期很短，而且它们在许多种类型的细胞上都起作用。但可以推测，只有在异常的情况下，它们在系统液体（如血清和血浆）中的含量的测定值才会很高。一些作用范围很广的蛋白（如细胞趋化因子、激素、生长因子等）在血清和血浆中的含量很高、半衰期很长且容易检测到的情况是不多见的。
Q：小鼠的免疫球蛋白抗体分型 CBA 试剂盒能不能用于定量小鼠的免疫球蛋白总量？
A：该试剂盒仅针对检测培养悬液中的抗体分型。由于该试剂盒并没有设立一个标准曲线，且血清和血浆中还有大部分的免疫球蛋白的亚型，因此不建议用于血清和血浆样品中的定量。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Mouse Th1/Th2/Th17 CBA Kit | 560485 | KIT |
| Ms Th1/Th2 CBA Std Lyo | 552967 | 1EA |
| Human Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array (CBA) Kit II | 551809 | KIT |
| Lake Red CBA | sc-487256 | 25g |
